Нейрон, нервная клетка - предмет пристального изучения нейрофизиологов, нейрокибернетиков, биофизиков, биохимиков, молекулярных биологов, нейрофармакологов, цитофармакологов.
Глава 1. Ионные механизмы функционирования нервных клеток
К настоящему времени известно много типов живых клеток. Например, у человека среди четырех основных тканей: эпителиальной, соединительной, мышечной и нервной насчитывается около 200 специализированных клеток. Разнообразие фенотипов клеток и набора в их мембранах определенных молекулярных структур детерминируется различной комбинацией экспрессируемых генов. Сама же экспрессия ионных каналов регулируется многими факторами (Buonanno, Fields, 1999; Rosati, McKinnon, 2004). Транскрипция генов определяет развитие, дифференцировку и функционирование клеток. Нервные клетки, как основные структурно-функциональные элементы нервной системы, для обеспечения интегративных функций в организме содержат в своих мембранах различного рода рецепторы, ионные каналы и транспортеры. Все эти молекулярные структуры и являются ионными исполнительными механизмами процессов интеграции: восприятия, переработки, хранения и воспроизведения информации, кодируемой как уровнем возбудимости и функционального состояния клеток, так и характером генерируемых ими электрических и химических импульсов.
Прежде всего, следует остановиться на некоторых общих представлениях о молекулярной организации клеточных мембран и ионных каналов, которые необходимо иметь в виду, чтобы перейти к изложению механизмов их функционирования. Во всех клетках поверхностные мембраны для ионов и молекул выполняют функцию барьера, отделяющего клетку от окружающей среды, и являются структурной основой для функционирования рецепторов и ферментов. Все внутриклеточные структуры: митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, пероксисомы, фагосомы, синаптосомы и т.д. также представляют собой замкнутые мембранные везикулы (пузырьки). Ядро клетки окружено, так называемой, ядерной мембраной (Фалер, Шилдс, 2004). Биологические мембраны имеют сходное универсальное строение и состоят из двух слоев липидов со встроенными в них белками. Каждый тип мембран имеет специфический набор белков – рецепторов и ферментов. Углеводы содержатся в форме гликопротеинов, гликолипидов и составляют 0,5–10 % вещества мембраны. Гликолипиды внешнего слоя плазматических мембран могут содержать углеводные функциональные группы, которые ориентируются в наружную водную фазу клетки (Кольман, Рем, 2000) (рис. 1).
Липиды мембран имеют в своей структуре две различные части: неполярный гидрофобный «хвост» и полярную гидрофильную «головку». Такую двойственную природу соединений называют амфифильной. Липиды мембран образуют двухслойную структуру. Два монослоя ориентируются «хвост к хвосту» так, что образующаяся структура двойного слоя имеет внутреннюю неполярную часть и две полярные поверхности. Каждый слой состоит из сложных липидов, расположенных таким образом, что неполярные гидрофобные «хвосты» молекул находятся в тесном контакте друг с другом. Так же контактируют гидрофильные части молекул. Все взаимодействия имеют нековалентный характер. В мембранах содержатся липиды трех классов: фосфолипиды, холестерин и гликолипиды. Наиболее важная группа, фосфолипиды, включает фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит и сфингомиелин. Холестерин присутствует во внутриклеточных мембранах животных клеток, за исключением внутренней мембраны митохондрий.
Фосфолипиды относятся к жидким кристаллам. Как в любом реальном кристалле, в пленке из фосфолипидов в процессе жизнедеятельности могут возникать многообразные дефекты, но наиболее естественным для бислоя является дефект типа сквозной гидрофильной поры. Эти поры появляются в результате тепловых флуктуаций поверхности бислоя, электрического пробоя, замораживания пленки, действия поверхностно-активных веществ, изменений осмотического давления, перекисного окисления липидов и др. При этом возможны изменения всех функций клеточной мембраны, включая проницаемость и стабильность (Brown, London, 1998).
Биологические мембраны находятся под действием электрического поля большой напряженности, создаваемого диффузией ионов через мембрану, электрогенными ионными насосами и фиксированными зарядами (Антонов, 1982, 1996). Поскольку разность потенциалов между цитоплазмой и внеклеточной средой достигает порядка 0,1 В, а толщина мембраны не превышает 10 нм, то напряженность поля достигает 107 В/м. Интересно отметить, что мембрана является более совершенным электрическим изолятором, чем многие жидкие изоляторы, применяемые в технике.
В некоторых случаях, например, у пресноводных водорослей, бактерий, энергизованных митохондрий мембранный потенциал может достигать 0,2 В. В возбудимых нервных и мышечных клетках в процессе их нормального функционирования происходит кратковременная реполяризация мембраны с ростом величины потенциала, однако пробоя клеточной мембраны не происходит. В то же время рост мембранного потенциала в результате воздействия внешним электрическим полем может достигать величины, превышающей пороговую для электрического «пробоя» (Владимиров, 1987, 2005). В таких случаях появляются структурные дефекты типа сквозных липидных пор. Если липидная пора будет превышать некоторый критический размер, то мембрана порвется, а если нет, то ее структура сохранится. При восстановлении стабильности мембран поры затягиваются. На последних этапах затекания липидные поры могут превращаться в водные поры.
Липидные поры в отличие от белковых ионных каналов не обладают выраженной избирательностью. По гидрофильным липидным порам могут транспортироваться высокомолекулярные вещества, ионы и молекулы воды. В процессе затекания они достигают размера, недостаточного для прохождения гидратированных ионов, но доступного для прохождения более мелких частиц – молекул и ионов воды. Минимальные диаметры липидных пор могут быть сравнимыми с порами избирательных белковых каналов, регулирующих в норме ионную проницаемость клеточных мембран и тогда, например, при возбуждении они могут участвовать в переносе ионных токов в мембране. После выключения внешнего электрического воздействия бислойная липидная мембрана вновь возвращается в состояние с низкой проводимостью, т.е. размер пор становится недостаточным для прохождения гидратированных ионов. Кроме того, под влиянием некоторых воздействий может происходить фазовый переход мембранных липидов из кристаллического состояния в гель-состояние, который сопровождается скачкообразным уменьшением коэффициента проницаемости для ионов и молекул воды. В ходе такого фазового перехода из множества липидных пор большого размера формируются мелкие, радиус которых не превышает 2 нм.
Следовательно, любое воздействие механической, физической или химической природы, затрагивающее поверхностное натяжение липидного бислоя, является фактором стабилизации поросодержащих мембран. Фармакологические вещества также могут менять жидкостно-кристаллическое состояние липидов мембран, т.е. оказывать на них стабилизирующе-дестабилизирующее воздействие и быть факторами модуляции состояния липидной фазы мембраны (Антонов, 1982; Конев, 1987; Антонов и соавт., 1992).
Белки мембран включены в липидный двойной слой двумя способами: гидрофильные радикалы аминокислот поверхностных мембранных белков связаны нековалентными связями с гидрофильной поверхностью липидного бислоя; интегральные мембранные белки погружены в гидрофобную область бислоя. Интегральные белки различаются по степени погруженности в гидрофобную часть бислоя. Они могут располагаться по обеим сторонам мембраны и при этом либо частично погружаются в мембрану, либо располагаются трансмембранно. Погруженная часть интегральных белков содержит большое количество аминокислот с гидрофобными радикалами, которые обеспечивают гидрофобное взаимодействие с липидами мембран. Гидрофобные взаимодействия поддерживают определенную ориентацию белков в мембране. Гидрофильная выступающая часть белка не может переместиться в гидрофобный слой. Часть мембранных белков ковалентно связана с моносахаридными остатками или олигосахаридными цепями и представляет собой гликопротеины. В отличие от нерастворимых фибриллярных белков растворимые белки имеют почти сферическую (глобулярную) форму. Глобулярным белкам свойственна высокоупорядоченная пространственная структура (конформация), которая способствует выполнению специфических биологических функций (Албертс и соавт., 1994).
Подвижными в мембране являются не только липиды, но и мембранные белки. Если белки не закреплены в мембране, они «плавают» в липидном бислое как в жидкости. Поэтому говорят, что биомембраны имеют жидкостно-мозаичную структуру (рис. 1). При этом «дрейф» белков в плоскости мембраны происходит достаточно легко, переход их с внешней стороны мембраны на внутреннюю («флип-флоп») не возможен, а переход липидов происходит крайне редко. Для «перескока» липидов необходимы специальные белки транслокаторы. Исключение составляет холестерин, который может легко переходить с одной стороны мембраны на другую.
Интегральные мембранные белки имеют трансмембранные спирализованные участки (домены), которые однократно или многократно пересекают липидный бислой. Такие белки прочно связаны с липидным окружением. Периферические мембранные белки удерживаются на мембране с помощью липидного «якоря» и связаны с другими компонентами мембраны; например, они часто бывают ассоциированы с интегральными мембранными белками. У интегральных мембранных белков фрагмент пептидной цепи, пересекающий липидный бислой, обычно состоит из 21–25 преимущественно гидрофобных аминокислот, которые образуют правую трансмембранную α-спираль с 6 или 7 витками (Фалер, Шилдс, 2004).
Под первичной структурой понимают аминокислотную последовательность полипептидной цепи. Например, инсулин был первым белком, строение которого было установлено полностью еще в начале 50-х годов. Молекула функционально активного инсулина состоит их двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями.
Вторичными структурами называют участки полипептидной цепи с упорядоченной конформацией, стабилизированной водородными связями. В большинстве глобулярных белков присутствуют одновременно как α-спирали, так и β-складчатые листы. Кроме того, имеются участки с неупорядоченной структурой. Распространенным структурным элементом глобулярных белков является β-петля. В молекуле инсулина участки, имеющие форму α-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на β-складчатую структуру, 10 % построено в виде β-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры.
Трехмерные функционально активные конформации белков носят название третичной структуры, которую исследуют методом кристаллографии. Этот трудоемкий метод основан на дифракции рентгеновских лучей в белковых кристаллах. Ha основании дифракционных картин с помощью компьютера рассчитывают распределение электронной плотности в кристалле и восстанавливают пространственную структуру молекул белка с атомным разрешением. В настоящее время определены трехмерные структуры сотен белков. Однако многие белки пока нельзя изучить этим методом, поскольку их не удается получить в виде хорошо сформированных кристаллов достаточно крупных размеров.
Белковые молекулы часто образуют симметрично построенные комплексы, стабилизированные за счет нековалентных взаимодействий. Такие комплексы называются олигомерами, а составные комплексы от 2 до 12 единиц – субъединицами или мономерами. Все вышеизложенные представления о некоторых свойствах белков полностью применимы к трансмембранным ионным каналам (Геннис, 1997).
Многие белки осуществляют транспортные функции. Простейшей формой транспорта через биомембраны является свободная, облегченная диффузия. Она осуществляется мембранными белками, которые можно разделить на две группы:
1. Канальные белки образуют в биомембранах заполненные водой поры, проницаемые для определенных ионов. Например, имеются специфические катионные ионные каналы для Na+, К+, Са2+ и анионные, например, для Cl–. Ионные каналы, формирующие потенциалы действия возбудимых клеток, относятся к потенциалоуправляемым каналам. Три главных семейства формируют ядро этого класса: K+, Na+, и Ca2+-каналы. Структурно самые простые – K+-каналы, которые произошли от прокариот около 2400 миллионов лет назад, а более сложные и эволюционно самые молодые – Na+-каналы (Goldin, 2002) многоклеточных эукариот, которые произошли около 800 миллионов лет назад, вероятно, из калиевых через Ca2+-каналы (Ranganathan, 1994). В самом общем виде все каналы имеют сходную симметричную структуру, построенную из четырех субъединиц или доменов. Так K+-каналы – тетрамеры, состоящие из четырех отдельных, но одинаковых альфа-субъединиц, а Ca2+ и Na+-каналы – мономеры, организованные одним альфа-белком, но содержащем четыре одинаковых домена.
2. В отличие от ионных каналов транспортные белки избирательно связывают молекулы субстрата и за счет конформационных изменений переносят их через мембрану. К субстратам, подлежащим переносу, они проявляют специфичность. Кроме того, для них характерны определенное сродство, выражаемое в виде константы диссоциации Kd и максимальная транспортная способность, характеризующая скорость переноса.
Свободная диффузия и транспортные процессы, обеспечиваемые ионными каналами и переносчиками, осуществляются по электрохимическому градиенту. Такие механизмы транспорта классифицируются как пассивный транспорт. Например, по такому механизму в клетки поступает глюкоза из крови, где ее концентрация гораздо выше.
В противоположность этому механизму активный транспорт осуществляется против градиента концентрации или заряда, поэтому он требует притока дополнительной энергии, которая обычно обеспечивается за счет гидролиза АТФ. Некоторые транспортные процессы осуществляются за счет гидролиза других макроэргических соединений, таких, например, как фосфоенолпируват, или за счет энергии света. С помощью транспортных систем осуществляется регуляция объема клеток, величины рН и ионного состава цитоплазмы. Благодаря транспортным системам клетки накапливают метаболиты, важные для обеспечения энергетического цикла и обменных процессов, а также выводят в окружающую среду продукты обмена и токсические вещества. Во всех клетках имеются ионные насосы (ионтранспортирующие АТФ-азы), осуществляющие постоянный перенос таких катионов, как Н+ и Na+, K+ и Са2+ и создающие электрохимический градиент, необходимый для эффективной деятельности возбудимых мышечных и нервных клеток.
Механизмы биоэлектрической активности нейронов
Электровозбудимые клетки для сохранения своей жизнедеятельности и функционирования должны поддерживать на плазматической мембране необходимую разность потенциалов между наружной и внутренней ее сторонами в диапазоне от –30 до –90 мВ внутри клетки, так называемый мембранный потенциал покоя (ПП). Функциональная активность таких клеток, межклеточные взаимодействия связаны с генерацией как местных, медленно изменяющихся ритмоводящих – пейсмекерных и синаптических потенциалов, так и распространяющихся потенциалов действия (ПД), быстроразвивающихся и передающихся по возбудимым мембранам на большие расстояния. В основе каждого вида биопотенциалов лежат соответствующие мембранные и внутриклеточные молекулярные механизмы (Костюк, Крышталь, 1981; Hille, 2001).
Многочисленными исследованиями показно, что в состоянии покоя в клетках основной является проницаемость мембраны для К+. Вследствие выхода из клетки К+, а также низкой проницаемости мембраны для крупных внутриклеточных органических анионов наружная поверхность мембраны заряжена положительно, а внутренняя – отрицательно. Вместе с тем в нейронах моллюсков сравнение величин калиевых равновесных потенциалов, рассчитанных на основе измерений вне- и внутриклеточной концентрации и активности ионов К+, с экспериментальными величинами ПП указывает на существенные расхождения между ними. Так, для нейронов беспозвоночных, потенциалы покоя в среднем на 20 мВ ниже расчетного калиевого равновесного потенциала. Эти расхождения связаны с наличием существенной фоновой проницаемости мембраны для ионов Na+. Удаление их из внеклеточного раствора приводит к отчетливой гиперполяризации мембраны и приближению величины мембранного потенциала к величине, теоретически рассчитанной для калиевого электрода. Определенный вклад в формирование мембранного ПП вносят ионы хлора, но они быстро перераспределяются между вне- и внутриклеточной средой и оказываются в равновесии.
Концентация Na+ в клетке регулируется двумя типами ионных каналов – потенциалозависимыми и потенциалонезависимыми, а также антипортерами (ионообменниками) (Kang, Hilgemann, 2004). Основная функция потенциалозависимых Na+-каналов состоит в генерации токов для перезарядки мембранной емкости и формировании восходящей части ПД. Эти каналы, как правило, локализованы в аксонах, в перехватах Ранвье, в пре- и постсинаптических мембранах.
Поддержание ионных градиентов, необходимых для поляризации поверхностной мембраны, осуществляется путем активного транспорта К+ внутрь клетки и Na+ из клетки. Электрогенный активный транспорт возможен благодаря наличию в поверхностной мембране транспортной ферментной системы, основой которой является Na,К-зависимая аденозинтрифосфатаза (Na,К-АТФ-аза), использующая энергию макроэргических фосфатов (Крутецкая, Лонский, 1994; Крутецкая, Лебедев, 1998). Существуют специфические блокаторы Na,К-АТФ-азы. Так, при действии строфантина (оубаина) или низкой температуры (2–4о С) соматическая мембрана нейронов моллюсков деполяризуется на 7–15 мВ, что указывает на примерную величину вклада электрогенного транспорта в мембранный потенциал клетки в состоянии покоя. О значительной роли электрогенного активного транспорта в поддержании мембранного потенциала свидетельствуют также многочисленные исследования с внутриклеточной инъекцией Na+ как на нейронах моллюсков, так и нейронах млекопитающих (Caviers, Glynn, 1979). Причем время, в течение которого эта транспортная система способна восстановить равновесие между вне- и внутриклеточной концентрацией К+ и Na+, составляет от нескольких десятков мин у нейронов моллюсков до нескольких мин у нейронов млекопитающих.
В опытах с использованием метода фиксации потенциала после искусственного внесения в клетку дополнительных количеств Na+ регистрировался дополнительный трансмембранный ионный ток. Этот “насосный” ток имел входящее направление, пропорционален количеству избыточно вводимых в клетку ионов, подавлялся строфантином (оубаином), бескалиевым внешним раствором и низкой температурой. В условиях физиологической деятельности клетки и генерации нервных импульсов, в связи с развитием входящих натриевых токов повышается внутриклеточное содержание Na+. Это приводит к стимулированию работы электрогенного транспортного механизма, повышению уровня ПП и изменению порога возбудимости. Таким способом создается внутриклеточная система обратной связи, регулирующая электрическую возбудимость клетки. Так, после ритмической стимуляции нейронов благодаря активации Na,К-насоса возникает посттетаническая гиперполяризация мембраны, подавляемая оубаином. Известно также, что Na,К-АТФ-аза может функционировать и как ионофор, через который может осуществляться транспорт ионов без затраты энергии, а АТФ при этом выполняет лишь функцию катализатора.
Определенную роль в формировании мембранного потенциала нейрона играют фиксированные на мембране заряды, обусловленные наличием на ее поверхности отрицательно заряженных фосфатидильных остатков. Обнаружено, что увеличение содержания в растворе двухвалентных катионов, изменение его ионной среды и рН приводит к изменению мембранного потенциала. Основное функциональное значение фиксированных зарядов – создание повышенной примембранной концентрации противоионов внеклеточного раствора (Костюк, Крышталь, 1981). Предполагаются два основных механизма взаимодействия противоионов с фиксированными на мембране зарядами – специфическое связывание с группировками – носителями зарядов и экранирование зарядов противоионами. Оценка плотности фиксированных на мембране зарядов осуществляется косвенным путем – на основании измерений сдвигов вольт-амперных характеристик при воздействиях, способных экранировать или связывать поверхностные заряды. Показано, что сдвиги потенциалозависимых характеристик для различных ионных токов неодинаковы, что свидетельствует о неравномерном распределении фиксированных зарядов по поверхности мембраны что, по-видимому, связано с некоторыми различиями в фосфолипидном окружении соответствующих каналообразующих белковых структур (Schauf, Davis, 1976).
Современная концепция электрической возбудимости клеток основана на представлении о существовании в поверхностной мембране селективных ионопроводящих структур – ионных каналов, способных отвечать на скачки внутримембранного электрического поля изменением своей ионной проводимости. Классические работы А. Ходжкина и А. Хаксли показали, что в генерации нервного импульса мембраной нервного волокна участвуют два ее механизма – натриевый и калиевый, которые функционируют независимо друг от друга. Установлено, что в структуре ионных каналов существуют специфические заряженные “воротные” частицы, управляемые внешним электрическим полем и обеспечивающие открывание и закрывание каналов, т.е. проникновение ионов (Hille, 2001). Перемещение “воротных” частиц в электрическом поле приводит к возникновению малого, по сравнению с ионным, тока, названного рядом исследователей асимметричным током смещения. Этот ток впервые зарегистрировали в области натриевых каналов мембраны в гигантском аксоне кальмара (Armstrong, Bezanilla, 1973a, b) и перехвате Ранвье (Nonner et al., 1975). Показана так же возможность блокады ионных токов при избирательном подавлении их воротного компонента путем связывания воротных частиц со специфическими блокаторами. Таким действием по отношению к натриевым каналам обладает, например, аконитин (Крутецкая и соавт., 1977).
В мембране нейрона распространение нервного импульса определяется присутствием электрически управляемых натриевых каналов, открывание и закрывание которых ответственно за ПД. С биохимической точки зрения натриевый канал изучен еще не окончательно, но известно, что он является белком с молекулярным весом в диапазоне от 250000 до 300000. Диаметр поры этого канала составляет 0,4–0,6 нм; через такую пору могут проходить дегидратированные ионы натрия. В устьях канала и стенках поры имеется много заряженных аминокислотных групп, размещенных в критических точках. Эти заряды обусловливают наличие большого электрического дипольного момента, который меняется по направлению и по величине в соответствии с конформационными изменениями канала, сопровождающими переход из закрытого состояния в открытое (Doyle, 1998; Bezanilla, 2000).
Поскольку поверхностная мембрана клетки очень тонка, то трансмембранная разность потенциалов в 70 мВ создает внутри покоящейся мембраны сильное электрическое поле порядка 100 кВ/см. Изменения напряженности электрического поля могут переводить канал из закрытого состояния в открытое. Процесс открывания натриевых каналов под влиянием изменения потенциала мембраны называют активацией натриевых каналов. Этот процесс останавливается благодаря развитию натриевой инактивации. Трансмембранная разность потенциалов, явившаяся причиной открывания натриевых каналов, затем переводит их в особое закрытое конформационное состояние, отличного от состояния, характерного для канала в покое. Второе закрытое состояние, названное состоянием инактивации, развивается медленнее, чем процесс активации, так что до того, как каналы закроются под влиянием инактивации, они остаются короткое время открытыми. В состоянии инактивации каналы пребывают несколько миллисекунд, а затем возвращаются в нормальное состояние покоя.
Полный цикл активации и инактивации в аксоне нейронов в норме включает в себя открывание и закрывание тысяч натриевых каналов. Увеличение общей мембранной проницаемости может быть связано с открыванием и закрыванием некоторого числа каналов по закону «все или ничего» или с работой каналов, у каждого из которых проницаемость может меняться градуально. Это было доказано с помощью новой методики, которая соотносит флуктуации мембранной проницаемости с вероятностным характером конформационных изменений канальных белков. Анализ этих флуктуаций показывает, что натриевые каналы работают по закону «все или ничего» и что открывание каждого канала увеличивает проводимость мембраны на 8*10-12 Ом-1 (Олдрич, Йеллен, 1987; Сигворс и соавт., 1987).
Аксоны нейронов имеют также потенциалоуправляемые калиевые каналы, которые помогают прекращать нервный импульс, позволяя ионам калия выходить из аксона, противодействуя тем самым входящему потоку ионов натрия. В теле нейрона ситуация еще более сложная, поскольку мембрана содержит пять типов каналов. Различные каналы открываются с неодинаковыми скоростями, остаются открытыми на протяжении разных интервалов времени и являются избирательно проницаемыми соответственно для ионов натрия, калия или кальция. Если на аксон подается некоторый постоянный стимул, то в ответ на начало стимуляции он генерирует только одиночный импульс, а сома нейрона – целый ряд импульсов, частота которых определяется интенсивностью стимула. Пресинаптические терминали также содержат большое разнообразие ионных каналов (Зефиров, Ситдикова, 2002: Meir et al., 1999). Различная способность отдельных частей нейрона генерировать повторные импульсы определяется набором в них тех или иных ионных каналов.
В ряде работ были получены многочисленные данные о значительной роли ионов кальция в явлении электрической возбудимости клеток (Catterall, 2000). На мышечных волокнах ракообразных показано возникновение длительных кальций-зависимых ПД в безнатриевой среде при заблокированной с помощью тетраэтиламмония (ТЭА) калиевой проводимости. Затем было установлено наличие полноценных кальций-зависимых ПД на мембране мышечных волокон Balanus nubilis после искусственного снижения внутриклеточной концентрации кальция. Было сделано предположение о существовании специфического мембранного рецептора для Са2+ в области кальциевого канала. Кроме того, было показано участие Са2+ и в генерации ПД на мембране нервных волокон. На гигантском аксоне кальмара зарегистрированы две фазы входа Са2+. Первая, так называемая быстрая фаза по временным характеристикам совпадает с натриевым входящим током и блокируется тетродотоксином (ТТХ). На основании этих данных, а также измерения соотношения натриевой и кальциевой проводимости в натриевых каналах, которая оказалась близкой к 100 пСм, сделали вывод о возможности переноса быстрого тока Са2+ по натриевым каналам. Вторая, медленная фаза входа Са2+ в аксон сильно зависит от наружной концентрации кальция и характеризуется наличием участка с отрицательным сопротивлением на вольт-амперной характеристике. Временной ход этой фазы измеряется секундами в отличие от быстрой фазы, измеряемой миллисекундами. Медленная фаза входа Са2+ нечувствительна к блокирующему действию ТТХ и ТЭА, однако подавляется при внеклеточном приложении к мембране ионов магния, марганца, кобальта и верапамила.
В рамках современной концепции электрической возбудимости двухфазный вход ионов кальция в нервное волокно объясняется следующим образом: быстрый кальциевый ток переносится по натриевым каналам ввиду их неабсолютной селективности. Медленная фаза кальциевого входа связана с наличием в мембране специфических, собственно кальциевых каналов, обладающих как особыми кинетическими, так и фармакологическими свойствами.
По современным представлениям, ПД нейронов как позвоночных, так и беспозвоночных животных имеет мультиионную природу (Костюк, 1986). В формирование ПД вносят вклад три типа ионов: натрия, кальция и калия. Следует отметить, что роль ионов кальция в генерации ПД неодинакова в различных участках мембраны нейрона, а именно – в мембране сомы нейрона и в мембране аксональных отростков. В исследованиях на нейронах моллюсков (Adams, Gage, 1979; Adams et al., 1980) и млекопитающих показано, что аксон, в отличие от сомы всегда и полностью теряет возбудимость в безнатриевой среде и его ПД практически полностью блокируются специфическим блокатором натриевых каналов – ТТХ, что говорит о преимущественно натрий-калиевом механизме генерации ПД в данном участке мембраны. Напротив, в мембране сомы роль ионов кальция в формировании ПД становится более заметной (White et al., 1997). Однако соматическая мембрана в этом смысле все же неоднородна – близкие к начальному сегменту аксона участки генерируют преимущественно натриевые спайки, а удаленные от аксона – кальциевые (Костюк, 1986).
В абдоминальном ганглии аплизии имеется большое разнообразие нейронов (Chad et al., 1984). Они варьируют по величине, положению, форме, пигментации, по характеру импульсации и химическим веществам, посредством которых они передают информацию другим клеткам. Такие различия позволяют распознавать и называть индивидуальные клетки (Rl, L1, R15 и т.д.). Некоторые из этих различий проявляются в характере импульсации. Одни клетки обычно «молчат», другие спонтанно активны. Среди активных одни генерируют регулярные ПД, другие выдают повторные краткие залпы или серии импульсов. Теперь известно, что различия в импульсации объясняются разными типами ионных токов, генерируемых мембраной тела нейронов.
Итак, в механизме генерации ПД возбудимых клеток основное участие принимает три основных вида трансмембранных ионных каналов – натриевые, кальциевые и калиевые (Костюк, 1986; Крутецкая, Лонский, 1994; Крутецкая, Лебедев, 2000). Восходящая фаза деполяризации ПД развивается благодаря входу внутрь клетки ионов натрия или кальция, что может быть зарегистрировано как соответствующие входящие токи, а нисходящая фаза реполяризации вместе со следовой фазой гиперполяризации связана с выходящим током ионов калия.
Когда нервный импульс проходит по аксону к его окончанию, то из пресинаптической мембраны высвобождается нейропередатчик – медиатор. Он диффундирует к постсинаптической мембране следующей клетки, где индуцирует открывание химически управляемых каналов. Ионы, проходящие через открытые каналы, вызывают изменения потенциала, известные под названием возбуждающих или тормозящих синаптических потенциалов.
Например, аксон мотонейрона лягушки проходит на протяжении нескольких сотен микрон вдоль поверхности мышечной клетки, образуя несколько сотен синаптических контактов на расстоянии друг от друга порядка микрона. В каждой пресинаптической области легко обнаружить характерные синаптические пузырьки. В синаптическом пузырьке содержится около 10000 молекул медиатора – ацетилхолина. Когда нервный импульс достигает синапса, запускается цепь событий, кульминацией которых являются слияние пузырька с пресинаптической мембраной и происходящее благодаря этому высвобождение ацетилхолина в щель между пресинаптической и постсинаптической мембранами; этот процесс называют экзоцитозом. В последнее время были вскрыты многие детали событий, приводящих к экзоцитозу. Выяснилось, что слияние пузырьков с пресинаптической мембраной, по всей видимости, запускается быстрым, но кратковременным увеличением концентрации кальция в окончании аксона (Скок и соавт, 1987; Зеймаль, Шелковников, 1989).
Ацетилхолин, высвобожденный нервным импульсом, приводит к возникновению постсинаптического потенциала, длящегося всего около пяти миллисекунд. Поскольку постсинаптические потенциалы обусловлены работой каналов, управляемых химически, а не электрически, их параметры сильно отличаются от параметров нервного импульса. Они обычно меньше по амплитуде, имеют большую длительность и могут плавно меняться по величине в зависимости от количества выделенного медиатора и, следовательно, от числа открытых каналов. За тот короткий период, в течение которого канал остается открытым, через него проходит около 20000 ионов натрия и приблизительно столько же ионов калия. В результате этих ионных потоков трансмембранная разность потенциалов уменьшается почти до нуля. Насколько близко она подходит к нулю, зависит от того, как много каналов было открыто и как долго они оставались открытыми.
Постсинаптические рецепторы медиаторов фактически представляют собой крупные белковые молекулы, погруженные в полужидкую матрицу клеточной мембраны: части их торчат над и под мембраной подобно айсбергам. Выходящий на поверхность участок рецепторного белка и молекула медиатора имеют одинаковые очертания; они соответствуют друг другу наподобие ключа и замка. Взаимодействие медиатора с его рецептором меняет трехмерную форму рецепторного белка, инициируя этим определенную последовательность событий (Сергеев, Шимановский, 1987; Говырин, Жоров, 1994). Это взаимодействие может вызвать возбуждение или торможение нейрона, сокращение мышечной клетки, а также образование и выделение гормона клеткой железы. Многие рецепторы медиаторов имеют два функциональных компонента: центр связывания молекулы медиатора и пору, пронизывающую мембрану, избирательно проницаемую для определенных ионов – ионный канал. Связываясь с рецептором, медиатор меняет его форму так, что пора открывается и ионы, находящиеся внутри и снаружи клеточной мембраны, перемещаются вдоль градиента концентрации, оказывая этим возбуждающий или тормозный эффект на частоту импульсации нейрона. Будет ли электрический потенциал, создаваемый медиатором, возбудительным или тормозным, зависит от того, какие именно ионы перемещаются, и от направления их движения. Ацетилхолин является возбуждающим медиатором в синапсе между нервом и мышцей, потому что он заставляет положительно заряженные ионы натрия входить в клетку и понижать ее отрицательный потенциал покоя. ГАМК, напротив, соответствует рецептор, у которого пора избирательно проницаема для отрицательно заряженных ионов хлора. Когда эти ионы входят через открытые поры в воспринимающую клетку, они повышают трансмембранный потенциал и на время инактивируют клетку.
Различные типы химически управляемых каналов демонстрируют разную избирательность. Некоторые из них сходны с ацетилхолиновым каналом, пропускающим ионы натрия и калия почти без предпочтения. Другие каналы высоко избирательны. Изменение потенциала, возникающее на данном синапсе, зависит от избирательности открывающихся каналов. Если в клетку входят положительные ионы, происходит изменение потенциала в положительном направлении. Сдвиги потенциала в положительную сторону имеют тенденцию открывать электрически управляемые каналы и способствовать генерации нервных импульсов; в связи с этим они получили название возбуждающих постсинаптических потенциалов. Если положительные ионы калия выходят из клетки, происходит изменение потенциала в отрицательном направлении, что способствует закрыванию электрически управляемых каналов. Такие постсинаптические потенциалы противодействуют возникновению нервных импульсов, и поэтому они названы тормозными. И возбуждающие, и тормозные постсинаптические потенциалы обычны для нейронов мозга.
Другие медиаторы, например дофамин и норадреналин, по-видимому, действуют посредством более тонкого механизма. В середине 50-х годов было показано, что эти и другие медиаторы повышают или снижают концентрацию «вторичногого посредника» в воспринимающих клетках. Затем вторичныйй посредник передает электрические или биохимические эффекты медиатора, или «первого посредника». Вторичный посредник представляет собой небольшую молекулу циклического аденозинмонофосфата (цАМФ).
Белковый рецептор норадреналина или многих других медиаторов соединяется в мембране клетки-мишени с ферментом аденилатциклазой, которая катализирует превращение в клетке богатой энергией молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) в цАМФ. Аденилатциклаза обычно неактивна, но, когда норадреналин связывается с постсинаптическим рецептором, фермент автоматически включается и внутри клетки начинается быстрое превращение АТФ в цАМФ. Затем цАМФ действует на биохимический аппарат клетки, вызывая физиологическую реакцию, характерную для данного медиатора.
Система вторичного посредника сходна с эстафетой, в которой медиатор передает свое сообщение циклическому АМФ в мембране клетки (Зинченко, Долгачева, 2003). Разумеется, сигнал передается не одной, а многим тысячам молекул цАМФ, которые генерируются активированной аденилатциклазой, связанной с каждым занятым рецептором. В результате благодаря интенсивному образованию цАМФ очень слабый сигнал, создаваемый взаимодействием медиатора с рецептором, усиливается внутри клетки в несколько тысяч раз.
Показано, что цАМФ участвует в синаптическом действии нескольких медиаторов, в том числе норадреналина, дофамина, серотонина и гистамина (Girault, Greengard, 2004). ЦАМФ активирует специфические ферменты в постсинаптической клетке, именуемые белковыми киназами; затем эти ферменты катализируют внедрение фосфатных групп в специальные белки в мембране нейрона, изменяя ее проницаемость для ионов и тем самым изменяя уровень возбудимости клетки-мишени (Ткачук, Авакян, 2003). Поскольку система вторичного посредника работает сравнительно медленно по шкале времени нейронных событий, она больше всего пригодна для участия в более длительных эффектах медиаторов мозга, таких, как медленные сдвиги мембранного потенциала и, возможно, образовании следов долговременной памяти. Как только цАМФ передал свое сообщение дальше, он инактивируется в клетке под действием фермента фосфодиэстеразы. Поэтому препараты, ингибирующие этот фермент, повышают уровень цАМФ в постсинаптических клетках и усиливают действие медиатора.
По-видимому, существуют два основных типа медиаторных рецепторов: быстро действующие рецепторы, которые осуществляют передачу информации, регулируя проницаемость ионной поры, и медленно действующие рецепторы, которые вызывают образование вторичного посредника; последний в свою очередь опосредует эффекты, производимые медиатором в постсинаптическом нейроне. Для многих медиаторов имеется по два и более типов рецепторов. Например, реакция на ацетилхолин в синапсе между мотонейроном и мышечной клеткой осуществляется простым током ионов натрия через мембрану. Но в головном мозгу эффекты ацетилхолина в большинстве своем опосредуются, по-видимому, молекулой еще одного вторичного посредника, циклического гуанозинмонофосфата, или цГМФ. Точно так же недавно полученные данные позволяют думать, что дофамин действует на уровне двух разных типов рецепторов в головном мозгу: рецептора D1, который связан с системой вторичного посредника цАМФ, и рецептора D2, который с ней не связан (Parish et al., 2001).
Как только молекула медиатора свяжется со своим рецептором, она должна быть быстро инактивирована во избежание слишком длительного ее действия и нарушения точного контроля передачи. Нервные волокна способны проводить несколько сот импульсов в секунду только при условии, что постсинаптическая мембрана восстанавливает свой потенциал покоя за долю миллисекунды. Некоторые медиаторы инактивируются ферментами, находящимися в синаптической щели. Ацетилхолин, например, разрушается ферментом ацетилхолинэстеразой, которая за секунду расщепляет 25000 молекул медиатора.
Норадреналин инактивируется в синапсе по иному механизму: выделившийся из аксонного окончания, он снова быстро в него всасывается. Затем поглощенные молекулы норадреналина либо разрушаются ферментами – катехол-О-метилтрансферазой и моноаминоксидазой, которые содержатся в нервном окончании, либо возвращаются обратно в синаптические пузырьки. Позднее такие же механизмы возврата были найдены и для других медиаторов – дофамина, серотонина и ГАМК. Возврат имеет то очевидное преимущество перед разрушением фермента, что молекулы медиатора сохраняются в течение нескольких циклов выделения и поглощения.
Таким образом, разнообразие биопотенциалов в клетках, отражающее их функциональную деятельность, связано с наличием в мембранах клеток различных молекулярных структур в виде специализированных рецепторов, ионных каналов или внутриклеточных вторичных посредников.
Разнообразие ионных каналов и принципы их организации
Ионные каналы – интегральные белки (гликопротеины), пронизывающие липидный слой мембраны и способные при адекватных внешних воздействиях (изменение потенциала на мембране, действие медиатора, гормона или фармакологического агента) избирательно менять проницаемость мембраны для различных ионов (Na+, Ca2+, K+, Cl–).
Существенные успехи молекулярной биологии клетки в понимании структуры и функционирования ионных каналов, достигнутые за последние два десятилетия, связаны с усовершенствованием известных и появлением новых методов исследования. Следует упомянуть о таких методах как электрофизиологические, генетико-мутационные, биохимические, химические. Кристаллизация потенциалоуправляемых каналов и недавняя идентификация атомных структур некоторых типов K+-каналов обеспечили понимание на молекулярном уровне механизмов, управляющих ионной селективностью и проводимостью (Doyle et al., 1998). Велика роль фармакологических подходов, позволивших уточнить структуру, функционирование ионных каналов и возможности их модуляции (Laporte et al., 2004). Большая группа липидорастворимых веществ, включая локальные и общие анестетики, противоаритмические и антиэпилептические средства, растительные и животные токсины (аконитин, вератридин, батрахотоксин), используются при исследованиях ионных каналов. Эффекты многих из этих веществ могут наступать не только после проникновения в открытый ионный канал, но и из липидного бислоя, действуя прямо на S4-сегмент α-субъединицы – сенсор напряжения. Локальные анестетики связываются главным образом с сайтами S5 и S6 внутри центральной ион-проводящей поры (Strichartz, Ritchie, 1987; Anger et al., 1988; Butterworth, Strichartz, 1990).
Для понимания молекулярной динамики ионных каналов широко применяется компьютерное (математическое) моделирование. Понять же эволюцию ионных каналов позволяет сравнительное моделирование, основанное на относительном сходстве аминокислотной последовательности одних и тех же типов ионных каналов у разных животных. Разнообразие типов и подтипов ионных каналов чрезвычайно велико. Например, среди потенциалоуправляемых катионных каналов, ответственных за генерацию ПД нейронов и обеспечение их жизнедеятельности и функционирования, калиевые ионные каналы, по сравнению с натриевыми и кальциевыми, организованы несколько проще, но представляют собою наиболее разнообразную и интенсивно изучаемую группу каналов. Разнообразие всех ионных каналов касается их структуры, функций, биофизических характеристик, а также фармакологических свойств. Подробно описаны различные ионные каналы, встречающиеся в мембранах пресинаптических окончаний (Meir et al., 1999).
Основными свойствами ионных каналов являются избирательная проницаемость (селективность) для ионов и способность открываться и закрываться при различных воздействиях на мембрану (воротная функция). Воротный механизм каналов управляется сенсором внешнего стимула. В зависимости от его локализации выделяют группу каналов, имеющих собственный сенсор, входящий непосредственно в состав макромолекулы, и каналы, в которых сенсор внешнего сигнала пространственно разобщен с каналом и его взаимодействие осуществляется с помощью растворимых внутриклеточных посредников (рис. 2).
К первой группе относятся потенциалоуправляемые и лиганд-управляемые каналы (Hille, 2001; Ackerman, Clapham, 1997). Потенциалоуправляемые каналы открываются и закрываются благодаря изменению электрического потенциала на мембране (рис. 2, а, 1 – сенсор потенциала). Его срабатывание при изменениях потенциала приводит к открыванию или закрыванию ворот канала (рис. 2, а, 3) и перемещению ионов по каналу. Лиганд-управляемые каналы открываются при связывании с рецептором специфических агонистов (рис. 2, б, 1 – рецептор первичного посредника). Далее конформационный сигнал передается на вторичные внутриклеточные посредники (рис. 2, б, 4), а через них – на рецептор вторичных посредников (рис. 2, б, 5) и затем на ворота (рис. 2, б, 3), открывающие или закрывающие лиганд-управляемый канал. Ионные каналы представляет собой гликопротеиды, находящиеся в липидном бислое мембраны и связанные структурно с другими мембранными белками и элементами цитоскелета.
В структуре канала выделяют внутреннее и наружное устья, пору, воротные частицы и селективный фильтр. Стенки поры выполнены остатками гидрофильных аминокислот, а гидрофобные аминокислоты контактируют с липидами бислоя. Полисахаридные остатки локализованы на наружной поверхности канала. Считается, что селективный фильтр представляет собой наиболее узкий участок поры, образованный кольцом из 5–6 атомов кислорода и регулирующий проницаемость данного канала для определенных ионов (Hille, 1992) (рис. 3).
Работа воротных частиц (рис. 2, а и б, 3), обусловливающих процессы открывания и закрывания каналов, регулируется, в случае потенциалоуправляемого канала, сенсором напряжения – сегментом S4 (рис. 3, 2), структурно связанным с самим каналом и содержащим заряженные группы аминокислот. Этот сенсор способен перемещаться в мембране под влиянием электрического поля (Костюк, 1986; Крутецкая, Лонский, 1994; Hille, 2001).
Натриевые каналы
Потенциалоуправляемые натриевые каналы (Yu, Catterall, 2003; Catterall et al., 2003a, b) выполняют основную роль в генерации и проведении возбуждения в нервной клетке и нервных волокнах. Входящий ток ионов натрия, быстро нарастающий в ответ на деполяризующее смещение потенциала покоя и инактивирующийся при продолжающейся деполяризации, представляет собой основу электрической возбудимости аксональной мембраны (Костюк, Крышталь, 1981; Black et al., 1990; Hille, 2001). Входящий натриевый ток возникает и в соматической мембране нейронов позвоночных и беспозвоночных. Проводимость одиночных натриевых каналов в разных объектах составляет 4–24 пСм, при этом наиболее высокая их плотность отмечается в перехватах Ранвье, что обеспечивает быструю деполяризацию и высокую скорость проведения ПД от перехвата к перехвату. Кинетика натриевого тока состоит из двух основных фаз: INa сначала возрастает (активируется), а затем убывает (инактивируется). В натриевом канале выделяют воротные структуры двух типов: активационные m-ворота и инактивационные h-ворота (Goldin, 2003). Натриевые каналы проницаемы для 14 одновалентных катионов, в том числе для протонов и некоторых органических катионов, таких, как гидроксиламмоний и гидразин.
Селективность натриевых каналов соматической мембраны различных нейронов, аксональных и мышечных мембран позвоночных и беспозвоночных сходна (Крутецкая, Лонский, 1994; Крутецкая, Лебедев, 2000; Akaike et al., 1984; Kaneda et al., 1988), что указывает на их эволюционную общность (Plummer, Meisler, 1999). Селективный фильтр всех натриевых каналов представляет собой прямоугольник размером 0,31 0,51 нм, образованный восемью атомами кислорода. Ион Na+, проникая через селективный фильтр, частично теряет свою гидратную оболочку, сохраняя в ней всего 1–3 молекулы воды (Hille, 2001). При измерении проводимости натриевого канала на фоне значительного снижения рН среды установлено, что в состав селективного фильтра, по-видимому, входит как минимум одна анионная группа (вероятно, карбоксильная), создающая сильное электрическое поле и обеспечивающая селективность канала между X (Na+ > Li+) и XI (Li+ > Na+) рядами Эйзенмана. Установлено также, что протонирование этой группы зависит от потенциала и приводит к полному блокированию натриевого канала (Brodwick, Eaton, 1978), а алкалоидные нейротоксины (аконитин, вератридин, батрахотоксин) способны значительно уменьшать ее рКа и тем самым резко снижать селективность Na+-каналов. Еще одна кислотная группировка обнаружена в области входного устья натриевого канала. Известно, что она входит в состав рецептора ТТХ и ее протонирование не зависит от потенциала (Крутецкая, Лонский, 1994).
Существует количественное описание свойств натриевого канала, его энергетического профиля на основе теории абсолютных скоростей реакций Эйринга в виде так называемой трехбарьерной модели. Согласно этой теории, существует последовательность реакций связывания в энергетических ямах, разделенных энергетическим барьером, через которые последовательно проходит проникающий ион. Переход через i–й барьер определяется соответствующими константами скорости ki и k-i. Приближающийся к каналу гидратированный катион, вступая в контакт с карбоксильной группой, теряет часть гидратной оболочки, стабилизируясь в этом положении благодаря электростатическому притяжению отрицательно заряженного атома кислорода. Затем ион в виде “промежуточного комплекса” переходит энергетический максимум, который и обеспечивает селективность, после чего вновь связывается с некоторым количеством молекул воды и попадает во внутриклеточную среду.
В потенциалоуправляемом Na+-канале обнаружено несколько рецепторных участков для природных нейротоксинов и для некоторых фармакологических агентов (Marban et al., 1998). В наружном устье канала локализован рецептор для специфических блокаторов натриевых каналов – ТТХ и сакситоксина (STX). В гидрофобной области мембраны на границе между липидной фазой и пептидными цепями молекулы Na+-канала расположен рецептор для липофильных алкалоидных активаторов – батрахотоксина (BTX), аконитина, вератридина и грайанотоксина (GTX). На наружной поверхности Na+-канала выявлены участки специфического связывания с - и -токсинами скорпионов и токсинами морских анемон (АТХ-II), модифицирующих процессы натриевой активации и инактивации. Полагают, что рецептор для местных анестетиков располагается в центре канала между селективным фильтром и воротами (Ходоров, 1986; Strichartz, Ritchie, 1987; Ragsdale et al., 1994, 1996) (табл. 1).
В составе натриевых каналов различных тканей животных идентифицированы белковые субъединицы, количество которых у разных животных может варьировать. Наиболее крупная и общая для всех – -субъединица (260 кД), являющаяся, по-видимому, основным функциональным компонентом натриевого канала. Она представляет собой интегральный белок и содержит все функциональные домены Na+-канала: участки связывания для ТТХ, STX и других модуляторов, воротные частицы, селективный фильтр и т.д. 1-субъединица (38 кД) метится нейротоксинами с наружной поверхности мембраны. Полагают, что она играет важную роль в стабилизации структуры -субъединицы, поскольку натриевый канал функционально активен только в виде комплекса - и 1-субъединиц. 2-субъединица (33 кД) соединена с -субъединицей дисульфидной связью, ее функциональная роль в структуре Na+-канала на данном этапе исследований остается не ясной. Все три субъединицы содержат углеводные остатки, выступающие на наружную поверхность мембраны (Солдатов, 1987; Гелетюк, Казаченко, 1990; Catterall, 1993, 2000; Catterall et al., 2003b) (рис. 4, А).
В мембране макромолекула каналов фиксируются с помощью якорных белков анкирина и нейрофасцина. Натриевый канал представляет собой расшифрованный белок, состоящий из 2016 аминокислотных остатков, который находится в клеточной мембране в окружении белковых 1-субъединиц. Специальный ген SCN5A кодирует синтез натриевого канала.
Структурно -субъединица натриевого канала сходна с таковой у кальциевых каналов и состоит из четырех гомологичных (т.е. сходных) доменов, обозначаемых римскими цифрами I, II, III и IV (рис. 4, Б).
Каждый домен, в свою очередь, состоит из шести трансмембранных сегментов, граничащих как с внутриклеточным пространством, так и с околоклеточной средой – S1–S6. Аминокислотные соединения между сегментами называют линкерами или Р-участками. Белковая молекула канала сконфигурирована таким образом, что в ней имеются отверстия (поры) между сегментами S5 и S6. Диаметр поры составляет 1/2 миллионной части миллиметра. Молекулярные области, ответственные за важнейшие функции каналов, были установлены при помощи специальных методик, в первую очередь с помощью метода направленного мутагенеза. Модификации субъединиц, связанные с их «разрезанием» на части и последующим соединением концов в иных комбинациях, т.е. формирование новых субъединиц, называют сплайсингом. Так, было установлено, что сегмент S4 играет роль датчика изменений электрического напряжения. А работает вольтметр потому, что он во всех четырех доменах представляет собой альфа-спираль, в которой каждый третий аминокислотный остаток заряжен положительно. Сегмент S4 состоит из аминокислотных остатков с порядковыми номерами с 1623 по 1647. Другая очень важная особенность – это линкер, или компоновщик. Он соединяет между собой домены III и IV. Это небольшой отрезок аминокислотных остатков с номерами с 1471 по 1523. Эта цепочка аминокислот очень важна или, как говорят, критична для нормальной инактивации натриевого канала. При нарушении линкера канал начинает работать неправильно.
Так, удаление или врожденное отсутствие всего лишь трех аминокислот с порядковыми номерами 1505–1507 лизина, пролина и глутамина приводит к развитию синдрома удлиненного QT. Совсем недавно обнаружены еще две мутации, которые являются причиной этого синдрома: т.н. мутации R1644H в "вольтметре" и N1325S в месте соединения сегментов 4 и 5 (Brugada et al., 2005).
Известно, что механизм действия антиаритмических препаратов первой группы, т.е. блокаторов натриевых каналов, опосредован их связыванием с аминокислотными остатками шестого сегмента S6 четвертого домена на границе трансмембранной поры. Обнаружено, что ТТХ имеет высокий аффинитет к натриевым каналам мозговой ткани и скелетных мышц и значительно меньшее сродство к каналам миокарда. Это различие обусловлено тем, что ключевым звеном здесь является аминокислотный остаток в положении 373. В миокарде в этой позиции находится цистеин, а в других тканях – остаток ароматической аминокислоты (например, гистидина).
Разнообразие натриевых каналов (подтипов) довольно велико (Goldin et al., 2000), оно определяется различиями α- и β-субъединиц, а также многообразием комбинаций этих субъединиц. Сами же субъединицы кодируются соответствующими генами на молекуле ДНК (табл. 2 и 3).
Среди потенциалонезависимых Na+-каналов описано семейство амилорид-чувствительных (SCNN) эпителиальных каналов, обеспечивающих функции восприятия вкуса и представляющих собою гетеротримеры: αβγ или δβγ. SCNN1A(α), SCNN1B(β), SCNN1D(δ) и SCNN1G(γ)-субъединицы встречаются также в головном и спинном мозгу, формируя механочувствительные каналы (Hamill et al., 1996; Hu, Sachs, 1997; Hamill, Martinac, 2001). В нейронах головного мозга встречаются рН-чувствительные натриевые каналы BNAC1 (ACCN1) и BNAC2 (ACCN2), а BNAC4 – в гипофизе. Велико разнообразие ионообменников (антипортеров) семейства Na/H, участвующих в регуляции уровня рН и объема клеток. Эти переносчики также блокируются амилоридом. NAH1 (SLC9A1) встречается в мозжечке и нейронах ствола мозга; NAH2 (SLC9A2) – в митохондриях кишечника и почки; NAH3 (SLC9A3) не чувствителен к амилориду; NAH4 (SLC9A4) – в желудке; NAH5 (SLC9A5) – в мозгу, скелетной мышце, селезенке; SLC9A6 – в митохондриях мозга и скелетной мышцы; SLC9A7 – в затылочной доле мозга, скелетной мышце, секреторных тканях. Последний тип ионообменника не чувствителен к амилориду, но ингибируется бензамилом. Описаны также и другие натриевые антипортеры: SLC5A – транспортеры глюкозы/натрия; SLC5A1 – глюкозы/галактозы/Na; SLC5A3 – котранспортер Na/миоинозитол; SLC5A5 – симпортер Na/йод при врожденных гипотиреозах; SLC5A6 – зависимый от натрия поливитаминный транспортер; SLC24 – антипортер Na/К/Ca (Wang et al., 2000a).
В процессе онтогенеза организма и в условиях функциональной специализации клеток или их отдельных частей (сомы, дендритов, аксонов, пресинаптических терминалей) вследствие активации определенных генов происходит встраивание в мембрану соответствующих макромолекулярных комплексов – ионных каналов, рецепторов, траспортеров и т.п. Их функционирование зависит от массы внешних воздействий: концентраций тех или иных ионов, потенциала на мембране, фармакологически активных соединений, физических факторов и т.д. Натриевые ионные каналы и различные транспортеры экспрессируются в те или иные мембраны в различных комбинациях как по типам, так и по их численному представительству. Известно, что в аксонах, в перехватах Ранвье, в основном, представлены потенциалоуправляемые натриевые и калиевые ионные каналы, а в соме нейронов – также и кальциевые каналы. В пресинаптических мембранах встречаются различные натриевые, кальциевые, калиевые и хлорные каналы (Hume et al., 2000; Jentsch et al., 2002). Что касается потенциалоуправляемых натриевых каналов в пресинапсе, то их основная функция – генерация распространяющихся ПД, освобождающих по прибытию нейротрансмиттер в синаптическую щель. В большинстве терминалей число квантов передатчика, выделенного из пресинаптического нервного окончания, зависит от количества ионов кальция, поступающих в терминаль. Это, в свою очередь, зависит от амплитуды и продолжительности ПД. В дополнение к основной роли генерации ПД, натриевые каналы имеют также важное значение в регуляции внутриклеточной концентрации ионов Na+, которые, в свою очередь, воздействует на концентрацию ионов Ca2+. Если амплитуда и длительность ПД в пресинапсе важны для освобождения числа квантов медиатора, то увеличение концентрации ионов натрия в пресинапсе должно вызвать снижение синаптического выброса. Однако это противоречие в дальнейшем снимается вследствие активации антипортера натрия/кальция. Активность этого белка зависит от внутриклеточных и внеклеточных концентраций натрия и кальция, а также от мембранного потенциала. Следовательно, натриевые каналы могут регулировать функции нервного окончания.
Следует упомянуть также важный аспект, касающийся функций натриевых каналов в пресинаптических нервных окончаниях, – их роль в качестве мишени для токсинов и лекарственных препаратов, которые, блокируя или модулируя проводимость натриевых каналов, влияют на выход передатчика из нервных окончаний и, таким образом, регулируют межклеточные взаимодействия (Meir et al., 1999).
Функционирование натриевых каналов характеризуется четырьмя процессами: активацией при деполяризации, инактивацией после длительных деполяризаций, дезактивацией после реполяризации и регенерацией, когда канал выходит из инактивированного состояния. Некоторые из токсинов блокируют активацию натриевого канала и, таким образом, вызывают нервный паралич. Другие токсины вызывают постоянную активацию натриевых каналов, которая приводит к конвульсии и нарушениям нормальной подвижности животных.
В нескольких типах клеток были описаны особые натриевые каналы – «длительно открытые каналы», которые могут иметь существенную физиологическую и патофизиологическую значимость (Raggenbass, Dreifuss, 1992; Crill, 1996; Fleidervish, Gutnick, 1996; Ju et al., 1996; Hayward et al., 1997). Они обычно активируются в более широком диапазоне мембранных потенциалов, чем "нормальные" натриевые каналы, и их активность сохраняется в течение длительного времени. Однако никакого прямого доказательства их существования в нервных окончаниях пока нет. Если они действительно существуют, то могут воздействовать на мембранный потенциал терминали и, таким образом, модулировать выделение трансмиттеров.
Возможности модуляции активности натриевых каналов при действии на них фармакологических средств самых различных классов будут показаны далее в результатах наших исследований. Об особенностях экспрессии различных типов натриевых каналов в электровозбудимой мембране кардиомиоцитов будет сказано ниже.
Кальциевые каналы
Ионы кальция в нервных клетках выполняют многочисленные функции. Они участвуют при иницииации ПД (Nagano, Cooke, 1987; Mendelowitz et al., 1995), регулируют ритмическую активность, экспрессию генов, как вторичные мессенджеры участвуют в регуляции множества внутриклеточных биохимических процессов, а в пресинаптических мембранах опосредуют выброс нейропередатчиков (Clapham, 1995). Потенциалозависимые Са2+-каналы идентифицированы в мембране клеток, обладающих электрической возбудимостью (сердечная мышца, гладкомышечные клетки, нейроны, эндокринные клетки). В некоторых клетках помимо потенциалозависимой инактивации описана Са2+-зависимая инактивация (Chad et al., 1984), связанная с повышением внутриклеточного содержания кальция во время деполяризующего импульса (Костюк, 1986). Этот компонент инактивации устраняется при внутриклеточном введении Са2+-хелатирующих соединений. Кальциевые каналы эффективно блокируются двухвалентными катионами никеля, кадмия, кобальта, а так же органическими блокаторами (верапамил, D-600, нифедипин, нитрендипин, дилтиазем и др.). Выделяют несколько типов Са2+-каналов, отличающихся друг от друга уровнями активации и инактивации, временем нахождения в открытом состоянии, величиной проводимости и фармакологическими свойствами (Костюк и соавт., 1987; Вислобоков и соавт., 1995; Tsien et al., 1988; Crest et al, 1990; Akaike, 1991; Janis, Triggle, 1991; Spedding, Paoletti, 1992; Timmermann et al., 2002).
Все Са2+-каналы хорошо проницаемы для ионов Са2+, Sr2+ и Ва2+ и практически не проницаемы для одновалентных ионов Na+ и К+. Предполагается, что селективный фильтр Са2+-канала содержит два участка специфического связывания с двухвалентными катионами – наружный (у наружного устья канала) и внутренний. Наружный участок обладает высоким сродством к катионам Са2+, Sr2+ и Ва2+, причем связывание с ним этих катионов не зависит от потенциала. Внешний участок определяет селективность канала для одновалентных и двухвалентных катионов, а его активный центр представлен несколькими СООН-группами аминокислот, т.е. при связывании с ионами Са2+ происходит образование хелатных комплексов. При удалении Са2+ из связи с СООН-группами наружного селективного фильтра утрачивается селективность и Са2+-каналы начинают пропускать одновалентные катионы Na+ и К+. Структура внутреннего участка селективного фильтра включает одну СООН-группу, обеспечивает селективность Са2+-канала к различным двухвалентным катионам и связывание с последними зависит от потенциала. Кроме того, в структуре Са2+-канала обнаружен кальмодулинподобный участок. Предполагают, что он входит в состав рецептора для 4-дигидропиридинов. Энергетический профиль каналов имеет три барьера и две потенциальные “ямы”, соответствующие наружному и внутреннему селективным фильтрам (Костюк, 1986). Молекулярная структура Са2+-каналов (Catterall et al., 2003c) имеет значительные сходства с натриевыми, но представлена пятью белковыми субъединицами: 1, 2, , , (рис. 5).
Наиболее крупная 1-субъединица несет большинство функциональных свойств канала таких, как селективность, проводимость, чувствительность к мембранному потенциалу и блокирующим агентам (McFhee et al., 1995; Herlitze et al., 1997). Мембранная локализация субъединиц кальциевых каналов и формирование ионпроводящей поры 1-субъединицей показано на рис. 6, при этом сегменты S5 и S6 каждого из четырех доменов обращены внутрь и формируют стенки поры.
В -субъединице, непосредственно примыкающей к 1-субъединице на внутренней стороне канала, имеется участок фосфорилирования (De Waard et al., 1997; Cens et al., 1998). Субъединицы -натриевого и 1-кальциевого каналов имеют сходную молекулярную структуру (Catterall, 1993; Yang et al., 1993; Zhang et al., 1993, 1994).
В электровозбудимых нервных и мышечных клетках известно большое количество различных кальциевых каналов. Некоторые затруднения при обсуждении одних и тех же каналов возникают вследствие того, что авторы пользуются различными классификациями. Существует три подхода к классификации кальциевых каналов, которые в какой-то степени отражают историческое развитие знаний об этих каналах.
1. Классификация каналов по потенциалочувствительности. Вначале предполагалось, что есть только один тип кальциевых каналов. Однако вскоре было показано, что в мембране яйцеклетки морской звезды больше одного типа токов кальция. Впоследствии это же показали и для многих других клеток различных организмов (Reuter et al., 1982; Nilius et al., 1985; Nowycky et al., 1985; Bean et al., 1986). Кальциевые токи имели различные пороги активации: низкопороговые каналы (LVA) – те, в которых активация каналов развивается при деполяризации чуть выше ПП, и высокопороговые каналы (HVA) – т.е., в которых порог активации значительно выше ПП (около 0 мВ). Помимо различий по чувствительности к напряжению активации различные кальциевые каналы отличаются и по кинетике их активации и инактивации.
2. Фармакологическая классификация. A) L, N и T каналы. Дигидропиридины (DHP) действуют на каналы HVA (Hess et al., 1984), не оказывая влияния на LVA каналы (Bean, 1985). Нитредипин снижает активность каналов HVA, а BayK 8644 – их активирует (Hess et al., 1984). На основе DHP-чувствительности и кинетики каналы HVA были подразделены в DHP-чувствительные кальциевые каналы L-типа и DHP-нечувствительные каналы N-типа. Каналы LVA назвали кальциевыми каналами T-типа (Nowycky et al., 1985). Был найден ингибитор кальциевых каналов N-типа – токсин из морской улитки Conus geographus -conotoxin GVIA (McCleskey et al., 1987). Дигидропиридинчувствительные Са2+-каналы L-типа активируются при высоких потенциалах на мембране (свыше –10 мВ), характеризуются высокой проводимостью (25 пСм) и очень медленной кинетикой инактивации ( 500 мс). Они чувствительны к ингибирующему действию органических блокаторов кальциевых каналов, однако все эти вещества имеют разные участки связывания в канале. Каналы L-типа (Hockerman et al., 1995; Lacinova et al., 1996; Peterson et al., 1996; Soldatov et al., 1997; Motoike et al., 1999) идентифицированы в нейронах центральной и периферической нервной системы, в клетках миокарда (Nilius et al., 1985; Pogzig, Becker, 1994), скелетной (Beurg et al., 1999) и гладкой мускулатуры позвоночных, нейронах моллюсков. Регулируются G-белками, при этом наблюдается изменение кинетики активации, уменьшение “хвостовых токов”.
Са2+-каналы N-типа найдены в синаптосомах мозга крыс, а также в нейронах коры головного мозга и в спинном мозге. Активируются при высоких потенциалах (более –20 мВ), инактивируются в области от –120 до –30 мВ, инактивация относительно быстрая ( 50–80 мс), проводимость для ионов Ва2+ средняя (13 пСм). Эти каналы весьма устойчивы к блокирующему действию дигидропиридинов, но высокочувствительны к таковому ионов La3+ и по селективности близки к каналам L-типа. Полагают, что Са2+-каналы N-типа в пресинапсе регулируют высвобождение медиаторов. Наблюдается ингибирование Са2+-тока через эти каналы при активации G-протеина путем введения ГТФS внутрь клетки (Chen et al., 1995; Herlitze et al., 1996; Mori et al., 1996; De Waard et al., 1997).
Са2+-каналы Т-типа (Perez-Reyes et al., 1998) обнаружены во многих возбудимых и невозбудимых (фибробласты, В-лимфоциты) клетках, они активируются при слабой деполяризации (потенциалы более положительные, чем –70 мВ), быстро и потенциалoзависимо инактивируются ( 20–50 мс), характеризуются низкой чувствительностью к дигидропиридинам, амилориду, блокирующему действию Cd2+ и высокой к блокирующему действию Ni2+ и Са2+, а также низкой проводимостью (8 пСм в 110 мМ Ва2+). Считается, что каналы Т-типа обеспечивают пейсмекерную активность и вход Са2+ при отрицательных потенциалах. При активации регуляторного G-протеина введением внутриклеточного ГТФS вначале наблюдается увеличение тока, а затем его подавление.
B) Каналы P и Q типов. Дополнительный тип HVA кальциевых каналов первоначально нашли в клетках Пуркинье мозжечка и назвали каналом P-типа (Llinas et al., 1989; Hillman et al., 1991). Порог активации составляет –50 мВ, кинетика инактивации очень медленная ( 1с). Нечувствительны к дигидропиридинам, блокируются токсином яда паука Agelenopsis (FTX). Впоследствии обнаружили, что есть еще один тип чувствительного к напряжению HVA кальциевого канала: кальциевый канал Q-типа (Zhang et al., 1993). Различие между P- и Q-типами кальциевых каналов не значительны и они часто группируются, как P/Q-кальциевые каналы.
C) R-тип кальциевые каналы. В некоторых клетках после блокирования T, L, N, и P/Q-каналов соответствующими ядами оставалась часть кальциевого тока, активируемого при средних значениях потенциала между HVA и LVA, который блокировался ионами никеля. Эти каналы были названы каналами R-типа.
Представительство тех или иных типов кальциевых каналов в различных клетках или в различных частях клеток специфично и определяется, по всей видимости, соответствующими функциями (Timmermann, 2001). Так в мембранах аксонов почти нет кальциевых каналов, в дендритах, соме нейронов и пресинаптических волокнах их достаточно много. В поверхностной мембране пресинаптического нервного окончания встречаются потенциалоуправляемые каналы N, L, P, и Q-типов, лиганд-управляемый кальциевый канал LG и антипортер натрия/кальция. Во всех клетках есть также внутриклеточные кальциевые каналы, локализованные в мембранах цитоплазматического матрикса и митохондрий.
3. Молекулярная классификация. Была разработана номенклатура классификации Ca2+-каналов (Ertel et al., 2000). Выделяют потенциалоуправляемые Ca2+-каналы, другие Ca2+-каналы (лиганд-управляемые и другие внутриклеточные) и Ca2+-сенсоры.
Потенциалоуправляемые Ca2+-каналы содержат 4 или 5 различных субъединиц (рис. 5–6). Среди α субъединиц размером 160–273 kD известно 10 подтипов, которые представлены в различных тканях и обладают пептидной специфичностью (табл. 4).
Структурно 1-субъединица, как и в натриевых каналах, состоит из 4 повторяющихся доменов I–IV, каждый их которых содержит 6 α-спиральных трансмембранных сегмента S1–S6. Домен I ответственен за кинетику активации, положительно заряженный сегмент S4 формирует часть сенсора напряжения. Сегменты S5 и S6 формируют пору канала, эти сегменты III домена связывают верапамил и нифедипин.
Субъединицы α2δ (CACNA2D1–D4) размером 140–170 kD погружены в мембрану и модулируют функциональную активность канала, увеличивая амплитуду Ca2+-токов. Субъединицы α2 и δ экспрессируются одним геном и связаны между собой дисульфидными мостиками (рис. 6). CACNA2D1 встречается в скелетных мышцах, сердце, мозге, тонкой кишке; CACNA2D2 – в легких и яичках, мозге, сердце, поджелудочной железе; CACNA2 D4 – в сердце и скелетных мышцах.
Субъединицы β (CACNB) размером 52–78 kD локализуются внутри клетки в цитоплазме и имеют цAMФ-зависимые протеинкиназные участки фосфорилирования. Они модифицируют ток, потенциалозависимость, активацию, инактивацию, т.е. имеют регуляторные функции. Известны их подтипы: β1 (CACNB1) – в скелетной мышце, мозге, сердце, селезенке; β2 (CACNB2) – в мозге, сердце, легких, аорте; β3 (CACNB3) – в ряде тканей; β4 (CACNB4) – в мозге и почках (Foell et al., 2004). Перечисленные потдипы β-субъединиц могут связываться в мембране с различными α1 субъединицами: β1 ассоциирована с α1S, β1B – с α1B и α1E, β4 – с α1A.
Субъединица γ (CACNG) размером 32 kD встроена в мембрану, цитоплазматического домена не имеет, осуществляет регуляторные функции, вызывая небольшое увеличение пика Ca2+-токов и частоты активации каналов и сдвигает порог активации в сторону гиперполяризации мембранного потенциала. Известны подтипы: CACNG1 (γ) встречается в скелетной мышце, нервной ткани, легких; CACNG1 (γ2) – в нервной ткани; а также еще 6 субъединиц – CACNG3 – G8.
С точки зрения молекулярной структуры фармакологические типы потенциалоуправляемых Ca2+-каналов определяются, прежде всего, типом формирующих их α-1 субъединиц. L-тип (Long lasting) Ca2+-каналов формируется субъединицами: α1C, α1D, α1F, или α1S, α2δ, и β3А. Активность этих каналов подавляется дигидропиридинами, фенилалкиламинами, бензотиазепинами и кальцизептином. Активируются каналы сильной деполяризацией, инактивация деполяризацией слабая. Локализация каналов: α1S – в склетной мышце; α1D – в мозге (тело нервной клетки и проксимальные дендриты); α1C – в сердечной мышце; α1D – в нейроэндокринных клетках и α1F – в сетчатке. Общая функция L-каналов в мышце – сопряжение возбуждения и сокращения. Каналы Cav1.1 (α1S) в скелетной мышце функционируют также как сенсор напряжения.
N-тип Ca2+-каналов формируется субъединицами: α1B, α2δ и β1b, активируются при сильной деполяризации, инактивация медленная. Каналы сильно и необратимо блокируются -конотоксинами GVIA и MVIIA, они – DHP-нечувствительны. Локализуются в пресинаптических терминалях нервной ткани. В их структуре отсутствует γ-субъединица. Канал модулируется неизвестным гомологом протеинкиназосвязанного белка, который взаимодействует с PKC.
P-тип Ca2+-каналов образован из субъединиц: α1A, α2δ и β4a, активируются при значительной деполяризации, инактивация – медленная. Блокируются ядом паука (Funnel web spider), ω-агатоксином IVA и ω-конотоксином MVIIC. Каналы нечувствительны к дигидропиридину и ω-конотоксину GVIA. Они локализуются: в пресинаптической мембране, высокая концентрация High α1A-субъединицы наблюдается в мозжечке, клетках Пуркинье, в нервно-мышечном соединении и они участвуют в высвобождении трансмиттера.
Q-тип Ca2+-каналов формируется субъединицами: α1A, α2δ и β4a. Субъединица α1A является вариантом измененной α1A в P-типе канала. Активация каналов происходит при значительной деполяризации, инактивация – медленная. Q-каналы более чувствительны к блокированию ω-конотоксином MVIIC, чем каналы P-типа. Локализуются в зернистых клетках мозжечка, пирамидных клетках гиппокампа. Основная функция – высвобождение трансмиттера.
R-тип Ca2+-каналов формируется субъединицами: α1E (Cav2.3), α2δ и β1b, имеют высокий порог активации, быстро и потенциалозависимо инактивируются. Блокируются ядом SNX-482 – пептидом из африканского тарантула Hysterocrates gigas. Основная функция каналов – высвобождение трансмиттера и инсулина, они локализуются в зернистых нейронах мозжечка и дендритах пирамидных клеток гиппокампа.
T-тип (транзиторный) Ca2+-канал также, как и другие типы каналов, может формироваться различными α1-субъединицами. При формировании α1G-субъдиницей (Cav3.1) он имеет наиболее быстрое время восстановления после инактивации, локализуется в мозге, при этом участвует в генерации пачек импульсов в таламокортикальных нейронах и остроконечных волнообразных разрядов, опосредованных ГАМК-Б рецепторами. Канал, сформированный α1H-субъединицей (Cav3.2), имеет наиболее медленное восстановление после инактивации. Такие каналы широко распространены в почках и печени, а также в сердце, нервной и эндокринной системах. Они участвуют в генерации коротких пачек импульсов, подавление каналов опосредовано β2- и γ2-субъединицами G белка. Когда канал сформирован α1I-субъединицей (Cav3.3), то генерируются LVA токи, способствующие поддержанию электрической активности нейронов, поскольку активируются при слабой деполяризации, близкой к величине ПП. Локализуются эти каналы в нейронах мозга. Каналы активируются и инактивируются более медленно, чем типичные каналы Т-типа. Характеризуются маленькой проводимостью (~8 пСм), что эквивалентно проводимости одиночного канала для ионов Ba2+ и Ca2+. Активность канала регулируется с помощью рецепторов, связанных с G-белком, блокируются ионами никеля (особенно Cav3.2), мибефрадилом, куртоксином – пептидом яда южноафриканского скорпиона Parabuthus transvaalicus. Дигидропиридины с каналами Т-типа не связываются.
Лиганд-управляемые Ca2+-каналы из группы других Ca2+-каналов включают в себя Ca2+-транспортную ATP-азу, каналы выхода Ca2+ – рианодиновые рецепторы (RYR) и другие внутриклеточные Ca2+-каналы. В группе Ca2+-транспортных ATP-аз описаны 4 разновидности. Все они – гомотетрамерные комплексы, предположительно содержащие 6 трансмембранных сегментов. ATP2A1 встречаются в саркоплазматическом или эдоплазматическом ретикулуме и обеспечивают быстрые сокращения скелетных мышц, а ATP2A2 – медленные сокращения. Известны 2 их изоформы: SERCA2a – в сердце, обеспечивая медленные сокращения скелетных мышц и SERCA2b – в гладких мышцах и немышечных тканях. Другие разновидности ATP2B1, ATP2B2 и ATP2B4 встречаются в плазматических мембранах и осуществляют активацию каналов внутриклеточных мембран.
К лиганд-управляемым каналам относят также каналы выходящего Ca2+-тока, связанные с рианодиновым рецептором (RYR). Они активируются после активации соматических дигидропиридинчувствительных кальциевых каналов, т.е. выполняют функцию усиления сигнала. Активатором является рианодин, Ca2+, кофеин; первичный посредник – циклическая AДФ-рибоза (цAДФР), а вторичный – цAДФР-Ca2+-кальмодулин. Среди RYR-рецепторов описаны подтипы RYR1, которые локализованы в саркоплазматическом ретикулуме и обеспечивают приток ионов кальция, необходимый для процессов возбуждения и сокращения скелетных мышц. Их работа регулируется протеинкиназой A (PKA). RYR2 встречается в сердце, нарушения в их работе могут стать причиной желудочковой тахикардии и стресс-индуцированного полиморфизма. Рецепторы RYR3 обнаружены в мозге.
Следующий подтип, относящийся к лиганд-управляемым каналам – инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3) рецептор, структурно похожий на рианодиновые рецепторы. Активируется при увеличении внутриклеточной концентрации IP3 и вызывает высвобождение внутриклеточных запасов Ca2+ после стимуляции рецепторов на поверхности клетки. Локализуются в мембранах эндоплазматического ретикулума клеток мозга с функцией осцилляции сигнала.
Из других внутриклеточных Ca2+-каналов известны никотинамидаденин-динуклеотидфосфатный рецептор (НАДФ) и сфинголипидный рецептор (EDG1). НАДФ-рецепторы служат сигнальным триггером, блокируются высокими концентрациями НАДФ, а низкими – активируются, при этом высвобождается Ca2+ из тапсигаргин-нечувствительных запасов. Сигналом для них является циклическая АДФ-рибоза. Сфинголипидный рецептор чувствителен к продуктам сфинголипидного пути преобразования липидов, вторичным посредником является, вероятно, сфингозин-1-фосфат или сфингозилфосфорилхолин-5.
И, наконец, третья группа молекулярной классификации кальциевых каналов – Ca2+-сенсоры включают в себя тип A, который экспрессируется в фоторецепторных клетках, модулируется рековерином, визинином и S-модулином и тип B, встречающийся в нейронах. Среди типа В описан нейрональный кальциевый сенсор-1 (NCS1), ассоциированный с секреторными гранулами.
Таким образом, 1-субъединицу кальциевых каналов кодируют 10 различных генов (табл. 4). Каждый из генов может кодировать по крайней мере 18 различных каналов, которые и были идентифицированы в нервной системе (Snutch et al., 1990; Birnbaumer et al., 1994; Perez-Reyes et al., 1998). Четыре различных гена могут кодировать -субъединицу и их называют 1, 2, 3, и 4. Каждый из генов может экспрессировать восемь отличных субъединиц, которые также были идентифицированы в мозгу (Perez-Reyez et al., 1998; Isom et al., 1994;). Комбинации различных субъединиц (табл. 4) могут формировать сотни вариаций кальциевых каналов.
Локализация кальциевых каналов в различных тканях, как и в мембранах отдельных частей клеток, весьма разнообразна. Встречаются различные комбинации тех или иных типов кальциевых каналов, что, вероятно, определяется функциональным предназначением (табл. 5).
Например, в ретине крыс и в некоторых эндокринных клетках (Looez et al., 1992) L-тип образует каналы контроля секреции (Pan, Lipton, 1995), а на терминалях двигательного нерва, иннервирующих скелетные и гладкие мышцы, описаны только кальциевые каналы N-типа, управляющие процессами нейропередачи (Rittenhouse, Zigmond, 1991; Hamilton, Smith, 1992; Friedman, Duckles, 1994). В ЦНС крысы, в спинном мозге, стволе мозга, нейрогипофизе, мозжечке, среднем мозге, гиппокампе и коре мозга существует несколько типов кальциевых каналов. Сенсорные нейроны спинного мозга обладают главным образом кальциевыми каналами N-типа, но также L- и P-типа (Meyers, 1993). В нейрогипофизе есть L, N или N-подобные и P/Q-каналы (Stuenkel, 1990; Wang et al., 1993). В мозжечке, снова доминируют каналы P-типа, но с меньшим вкладом N-типа и нет каналов L-типа (Takahashi, Okamura, 1998; Regehr, Mintz, 1994) и т.п. В среднем мозге в высвобождение нейромедиаторов в различных типах нейронов включены многие кальциевые каналы (Turner et al., 1992). При выделении GABA доминируют каналы N-типа при небольшом участии L-типа (Kipk, Richardson, 1995), допамина – почти равен вклад N, L, и P/Q (Carvalho et al., 1995). В модуляции соответствующих рецепторов аденозином и АТФ (Pintor, Miras-Portugal, 1995) участвуют N- и L-каналы.
Модуляция кальциевых каналов в нервных окончаниях имеет ключевое значение в регулировании выделения передатчика. Есть много способов модуляции кальциевых каналов (Barrett, Rittenhouse, 2000). Она может осуществляться нейропередатчиком, высвобожденным тем же самым нервным окончанием через обратное действие на ауторецепторы продуктами разложения освобожденного передатчика; передатчиками, высвобожденными из других нервных окончаний; гормонами, выделяемыми во внеклеточную жидкость; антителами, фармакологическими препаратами и воздействием различных физических факторов среды. Некоторые из модулирующих воздействий могут быть вследствие прямого влияния на ионные каналы в нервных окончаниях (Акопян и соавт., 1984), тогда как другие осуществляются через действие вторичных посредников, G-белков. Большинство регулирующих воздействий на кальциевые каналы в пресинаптических нервных окончаниях изменяет вероятность открывания кальциевого канала и осуществляет частотную модуляцию синаптической передачи (Rahamimoff et al., 1993).
Многочисленные болезни и патофизиологические состояния в организме могут быть связаны с генетическими нарушениями и экспрессией неполноценных соответствующих субъединиц тех или иных типов Ca2+-каналов (Meir et al., 1999). С другой стороны многие заболевания обусловлены физиологическими нарушениями в работе каналов, а также патогенетическими внешними воздействиями различной этиологии. Коррекция многочисленных нарушений в работе кальциевых каналов возможна путем воздействия на них некоторых фармакологических средств, что будет показано нами далее.
Калиевые каналы
Калиевые ионные каналы имеют первостепенное значение для регуляции трансмембранного градиента К+. В дополнение к потенциалозависимым есть большой набор калиевых каналов, мало чувствительных к мембранному потенциалу и активируемых или блокируемых различными лигандами. Такие каналы поддерживают фоновую калиевую проводимость мембраны и формируют ПП возбудимых и невозбудимых клеток. В клетках позвоночных описано более 13 подсемейств, 8 из которых включают типично потенциалозависимые каналы, содержащие датчики напряжения.
K+-каналы, как натриевые и кальциевые, – трансмембранные белки, но избирательно пропускающие ионы K+, движущиеся по их электрохимическому градиенту со скоростью от 106 до 108 ионов/с. Ионпроводящий канал, состоящий из четырех -субъединиц, в своей структурно-функциональной организации имеет специализированные сегментные образования: 1) пору, заполненную водой, проницаемую для K+; 2) фильтр селективности, который пропускает только K+ и 3) механизм ворот, переключающий открытое и закрытое состояния канала в ответ на изменения мембранного потенциала или на связывание лиганда (Hille, 1992, 2001). К настоящему времени идентифицировано больше 200 генных кодов K+-каналов, которые содержат основную -субъединицу с пороформирующими сегментами S5–S6 или их аналогами, определяющими ионную избирательность (Hartmann et al., 1991; Yellen et al., 1991) и место взаимодействия с лекаственными средствами (Decher et al., 2004). Так у человека известно более 80 генов, связанных с такими каналами (Albrecht et al., 1995). В некоторых К+-каналах добавляется вспомогательная β-субъединица, модулирующая их свойства (Williams et al., 2002). В молекулярной структуре канала были выявлены области, ответственные за селективность, воротные функции, характер взаимодействия составляющих субъединиц, кодирующие гены канала и места связывания специфических ядов и фармакологических веществ.
Недавнее описание кристаллической структуры бактериального KCsA канала с разрешающей способностью 3,2 Å позволило выяснить многие детали структуры (Doyle et al., 1998). KCsA канал содержит только два трансмембранных сегмента с формируемой ими порой, не содержит потенциалоуправляемых ворот, так как отсутствует сегмент S4, но последовательность аминокислот этого канала подобна таковой в потенциалозависимом K+-канале. Рентгеновский анализ показал, что четыре идентичных субъединицы формирует тетрамер, создающий перевернутый конус, селективный фильтр поры на наружной стороне мембраны. Полная длина туннеля поры составляет 45 Å, а его диаметр по всей длине не постоянен. Внутреннее устье начинается как туннель длиной 18 Å, который около середины мембраны сужается до ~10 Å в диаметре и фильтрует ионы с высокой селективностью только до диаметра 12 Å. Выходное устье поры более широкое и выстлано гидрофобными аминокислотами. Фильтр селективности содержит карбоксильные атомы аминокислот и пропускает только K+-ионы (~3 Å), но не пропускает меньшие по размеру Na+-ионы, потому что диаметр поры для них слишком широк, чтобы заместить энергию гидратации Na+-ионов (Doyle et al., 1998). Селективность К+-каналов разных типов сходна. Проводимость их колеблется от 2 до 300 пСм, каналы блокируются при снижении рН наружного раствора вследствие протонирования кислотной группы, находящейся в нем (Костюк, Крышталь, 1981; Hille, Schwartz, 1978). Дальнейшее уточнение структуры всех компонентов ионных каналов позволит найти фармакологические средства, способные эффективнее корректировать работу K+-каналов (Sato et al., 1995; Edwards, 1998; Wickenden, 2002).
Современная классификация K+-каналов (Chandy, Gutman, 1993; Gutman et al., 2003) основана на учете последовательности аминокислот в субъединицах, определяемой генами, поэтому ее называют генетической. При этом принимается во внимание субъединичная структура, функции каналов и выделяют три их типа (Shieh et al., 2000).
1. Каналы с шестью трансмембранными сегментами и одной порой (рис. 7, А).
Семейство потенциалозависимых K+-каналов (Kv) включает каналы, связанные с генами: KCNA (Shaker – шейкер) – каналы Kv1.1–1.9; KCNB (Shab) – Kv2.1–2.2; KCNC (Shaw) – Kv3.1–3.4; KCND (Shal) – Kv4.1–4.3; c геном человека herg-go-go-related (hERG); Ca2+-активируемые K+-каналы; и KCNQ каналы, активируемые деполяризацией. -субъединицы потенциалозависимых K+-каналов состоят из сегментов S1–S6, они активируются при деполяризации. Пора и селективный фильтр формируются линкером S5–S6 (Heginbotham et al., 1994). Четыре субъединицы формируют функционально активный канал (MacKinnon, 1991). Соответственно, гетеромультимерный комплекс потенциалозависимого K+-каналa, как полагают, составлен из четырех α- и β-субъединиц, размещенных в тетрамере (MacKinnon, 1995; Jan, Jan, 1997) (рис. 8, А, С).
Внешнее устье канала, состоящее из частей P-цикла и смежных остатков S5 и S6 сегментов является местом связывания для токсинов и блокаторов K+-канала (Goldstein et al., 1993; Pascual et al., 1995). С другой стороны, внутреннее устье поры, состоящее из остатков S5 и S6 сегментов и находящихся на внутриклеточной стороне, связывает 4-АР, ТЭА и гуанидин (Lopez et al., 1994; Shieh, Kirsch, 1994; Yeola et al., 1996). S4–S5 линкеры находятся близко к поре и ответственны за инактивацию (Isacoff et al., 1991).
Сенсор напряжения и активация канала связаны с сегментом S4. Ранее его перемещение в мембране регистрировалось как воротный ток. S4 сегмент является главным компонентом датчика напряжения (Papazian et al., 1991; Perozo et al., 1994), который содержит положительно заряженные остатки лизина или аргинина приблизительно в каждом третьем положении, разделенном участками по 5–7 остатков аминокислот. Сходное строение сохраняется во всех потенциалозависимых каналах K+-семейства. Перемещение сегмента S4 в ответ на мембранную деполяризацию было подтверждено методом флюоресценции (Mannuzzu et al., 1996; Cha, Bezanilla, 1997). Сегмент S4 содержит главную часть датчика напряжения, требуемого для активации K+-канала (Elinder et al., 2001). Электростатическое взаимодействие с сегментом S4 отрицательных зарядов аминокислотных остатков в S2 и S3 сегментах способствует также функционированию ворот (Papazian et al., 1995; Seoh et al., 1996).
Многие потенциалозависимые K+-каналы при деполяризации активируются и инактивируются быстро. Были описаны три типа инактивации – N-, P- и C-инактивации, которые связаны с различными молекулярными доменами канала. Например, 6–46 аминокислоты N-конца шейкер K+-канала принимают участие в формировании N-типа инактивации. При закрывании поры из открытого состояния они перемещаются во внутреннее устье, сформированное S5–S6 сегментами (Hoshi et al., 1990; Isacoff et al., 1991). В отличие от быстрого процесса инактивации N-типа, C- и P-типы инактиваций соответствуют более медленным конформационным изменениям определенных аминокислотных остатков во внешнем устье поры (Hoshi et al., 1990; Yellen et al., 1994; Liu et al., 1996).
2. Каналы с двумя трансмембранными сегментами и одной порой – K+-каналы внутреннего выпрямления (Kirs), состоящие из -субъединицы с двумя трансмембранными сегментами M1 и M2 (рис. 7, В, в правой части) и пороформирующим линкером между ними, отдаленно относится к суперсемейству четырехсегментных каналов (Ho et al., 1993; Kubo et al., 1993a, b). Эти каналы проводят K+-токи преимущественно во внутреннем направлении и они важны для поддержания мембранного ПП (Doupnik et al., 1995). Такое внутреннее выпрямление обусловлено механизмом ворот, внутриклеточным Mg2+, полиаминами спермином, спермидином и т.д., которые закрывают доступ K+ к внутреннему устью ионпроводящей поры (Ficker et al., 1994; Lu, MacKinnon, 1994; Wible et al., 1994). Подобно потенциалозависимым K+-каналам эти каналы организованы как тетрамеры (Yang et al., 1995), хотя для АТФ-зависимого K+-канала была описана более сложная октамерная организация. Она включает четыре центральных субъединицы типа каналов внутреннего выпрямления, формирующих проводящую пору, и четыре наружных регулирующих субъединицы – рецепторов сульфонилмочевины (Inagaki et al., 1997; Shyng, Nichols, 1997).
3. Каналы с четырьмя трансмембранными сегментами и двумя порами (рис. 7, С). Среди этих каналов описано семейство из 50 различных каналов (Wang et al., 1999d) со слабым внутренним выпрямлением, предположительно состоящих из субъединиц с четырьмя сегментами и двумя порами (рис. 7, С) (Ketchum et al., 1995; Lesage et al., 1996). Хотя все каналы с двумя порами имеют сходную по составу основную область субъединицы между сегментами M1 и M4, но амино- и карбоксильные концы их весьма разнообразны. Возможно, что две субъединицы с двумя порами могли бы формировать полноценный псевдотетрамерный канал.
По функциям различают потенциалоуправляемые K+-каналы, среди которых основная группа – каналы задержанного (выходящего) выпрямления; входящего выпрямления (Kir); Ca2+-чувствительные K+-каналы; ATФ-чувствительные K+-каналы; Na+-активируемые; K+-каналы, чувствительные к изменению клеточного объема; тип «A» K+-каналы и рецептор-управляемые K+-каналы.
Потенциалоуправляемые K+-каналы различаются по зависимости от потенциала, способности инактивироваться, кинетике активации и инактивации, по фармакочувствительности (Крутецкая, Лонский, 1994; Black et al., 1990; Triggle, 1990; Hille, 1992; Bowden et al., 2003). Каналы активируются при деполяризации, присутствуют в возбудимых и невозбудимых клетках. Они регулируют ПП мембраны, определяют форму и частоту ПД.
K+-каналы задержанного (выходящего) выпрямления по своей структуре – тетрамеры, состоящие из четырех α- и β-субъединиц. Эти каналы обеспечивает эффективную реполяризацию ПД и рефрактерный период. Имеют отсроченную активацию и медленную инактивацию, постоянная инактивации составляет сотни мс. Все известные каналы такого типа блокируются при внутриклеточном действии ТЭА, их блокирует 4-АР, дендротоксины, фенциклидин, фаллоидин, 9-аминоакридин, маргатоксин, харибдотоксин.
K+ каналы входящего (аномального) выпрямления (Kir) выделяются в отдельный класс ввиду особенностей их молекулярной структуры, так как имеют 2 трансмембранных сегмента M1 и M2, соответствующие сегментам S5 и S6 потенциалоуправляемых каналов. Представляют собою гомотетрамеры или гетеротетрамеры из 4-х субъединиц вокруг центральной поры. Они участвуют в формировании возбудимости и проводимости в мышечных клетках и нейронах. Эти каналы определяют проводимость мембраны в покое, формируют плато на ПД и пейсмекерную активность миокарда. Особенностью каналов является то, что они при деполяризации мембраны не открываются, а пропускают ионы в области гиперполяриации мембраны и поток ионов направлен внутрь клетки, т.е. каналы обеспечивают большой входящий ток К+ при отрицательном потенциале по отношению к равновесному потенциалу калия. Полагают, что феномен аномального выпрямления связан с быстрым потенциалозависимым блокированием соответствующих каналов ионами внутриклеточного Mg2+. При потенциалах на мембране, превышающих величину равновесного калиевого, ионы Mg2+ входят в канал, взаимодействуют с отрицательно заряженными группами в его стенках и блокируют транспорт К+. Проводимость канала регулируется: внеклеточным K+, внутриклеточным Mg2+, внутриклеточными полиаминами, ATФ и G-белками. Они потенциалозависимо блокируются при внеклеточном действии ТЭА (Костюк и соавт., 1975а) ионов цезия, рубидия, натрия, бария и стронция. Блокаторами являются: яд гадюки, Sr2+, Ba2+, Cs+.
Ca2+-чувствительные K+-каналы состоят из 4-х субъединиц, на цитоплазматической стороне канала спирали субъединиц формируют пучок из RCK доменов, которые выполняют функцию ворот. RCK домены имеют гибкое соединение между собой, с гибким соединением связываются 2 Ca2+-иона, которые регулируют работу ворот. Проводимость этих каналов изменяется при изменении внутриклеточной концентрации ионов Са2+, они играют важную роль в поддержании ПП клетки по механизму отрицательной обратной связи: при деполяризации мембраны увеличивается вход ионов Са2+ внутрь клетки по потенциалозависимым каналам и происходит его мобилизация из внутриклеточных депо. Ионы кальция взаимодействуют со специфическим рецептором, расположенным на внутренней стороне К+-канала, сродство к которому также увеличивается при деполяризации мембраны, что приводит к активации К+-канала и увеличению выхода ионов К+ наружу (Shah, Haylett, 2000). Это в свою очередь вызывает гиперполяризацию мембраны, Са2+-каналы закрываются, уменьшается внутриклеточная концентрация Са2+ и ПП мембраны стабилизируется (Авдонин, Ткачук, 1994). В клетке после ее гиперполяризации Са2+-каналы принимают участие в генерации осцилляций мембранного потенциала. Са2+-регулируемые К+-каналы, управляемые наружным Са2+, на наружной поверхности мембраны имеют рецептор для Са2+. Их активность не зависит от мембранного потенциала и внутриклеточного Са2+, эффективно блокируется 4-АР. В большом количестве присутствуют в мембране гладкомышечных клеток сосудов, регулируют сосудистый тонус. Са2+-ингибируемые К+-каналы были обнаружены в мембране лимфоцитов человека. Проводимость этих каналов уменьшается при увеличении концентрации внутриклеточного Са2+. Среди Ca2+-чувствительных K+-каналов различают каналы с высокой проводимостью (BK), каналы с промежуточной проводимостью (IK) и каналы с низкой проводимостью (SK).
Каналы с высокой проводимостью закрываются и открываются мембранным потенциалом и внутриклеточным Ca2+. Их одиночная проводимость наиболее высокая – от 100 до 220 пСм, они обнаружены во многих тканях млекопитающих и человека. Их блокаторами являются: ибериотоксин, (+)-тубокурарин, харибдотоксин (пептид из яда скорпиона Leiurus), ноксиукстоксин, пенитрем-A, ТЭА.
Каналы с промежуточной проводимостью более чувствительны к Ca2+, чем BK каналы, их работа регулируется внутриклеточными ионами Ca2+, одиночная проводимость относительно низкая – от 20 до 85 пСм. Установлено, что их активность, помимо потенциала и внутриклеточного Са2+, может модулироваться цАМФ-зависимой протеинкиназой. По-видимому, для функционирования К+-каналов такого типа имеют значение процессы фосфорилирования. Блокаторы этих каналов: сцетидил, трифлюороперазин, галоперидол, но эти каналы нечувствительны к действию ТЭА.
Каналы с низкой проводимостью слабо зависят от потенциала. KCNN, ISK-семейство каналов более чувствительны к Ca2+, чем BK каналы, их работа регулируется внутриклеточными ионами Ca2+. В нейронах эти каналы формируют следовую гиперполяризацию ПД. Одиночная проводимость самая низкая – от 2 до 20 пСм, блокаторы – апамин (компонент пчелиного яда), лейротоксин 1, (+)-тубокурарин. Эти каналы так же нечувствительны к действию ТЭА.
Na+-активируемые K+-каналы – потенциалонезависимые: высокочувствительны к увеличению концентрации внутриклеточного Na+, но не чувствительны к изменению концентрации Са2+ и АТФ, блокируются Mg2+ и Ba2+. Они встречаются в нейронах позвоночных и беспозвоночных, в сердечной мышце, участвуют в формировании фазы реполяризации ПД. Na+ активируемые K+-каналы эффективно блокируются ТЭА и 4-АР.
K+-каналы, чувствительные к изменению клеточного объема, активируются при увеличении клеточного объема, их блокаторами являются квинидин, лидокаин, цетидил.
Тип «A» K+-каналов – тетрамеры, содержат α-субъединицы и внутриклеточные β-субъединицы, которые могут изменять быструю фазу инактивации. Каналы характеризуются быстрой активацией и инактивацией. Они регулируют быструю фазу реполяризации ПД, т.е. межимпульный интервал ритмической активности. Их блокируют: 4-АР, квинидин, пептид дегрануляции тучных клеток, фенциклидин, дендротоксин.
Рецептор-управляемые K+-каналы – тетрамеры с медленной инактивацией или совсем неинактивирующиеся (KCNJ3 и KCNJ5). Среди них есть каналы, активируемые мускарином и встречающиеся в предсердиях. Каналы, активирующиеся агонистами β-адренорецепторов, инактивируются мускарином. Активатор каналов – соматостатин, а блокаторы – Ba2+ и брадикинин. Имеются каналы со свойствами входящего выпрямления, они блокируются Ba2+, Cs+, 4-АР, TEA и квинином.
Следовательно, разнообразие калиевых ионных каналов весьма велико, они экспрессируются в тканях и органах, вероятно, для выполнения определенных функций. Нарушения экспрессии калиевых каналов приводят к соответствующим каналопатиям и изменениям в их нормальной работе (Shieh et al., 2000), как это показано для натриевых и кальциевых каналов (Lehmann-Horn, 1999; Felix, 2000).
Ионные каналы в кардиомиоцитах млекопитающих
К настоящему времени в плазматической мембране кардиомиоцитов известны все основные ионные токи, активирующиеся и последовательно инактивирующиеся при каждой фазе сердечного ПД (Пидопличко, Верхратский, 1989), а также соответствующие гены и клонированные субъединицы каналов. В сердечных клетках важнейшими ионными каналами являются: Na+- и Ca2+-каналы, обеспечивающие вход Na+ и Ca2+ в клетку; различного рода K+-каналы, осуществляющие выход K+ из клетки (Snyders, 1999). Все названные каналы являются интегральными трансмембранными транспортными белками, катионными ионными каналами, принципиально сходными по структурно-функциональной организации, имеющими как сходные, так и отличающиеся элементы, ответственные за селективность и движение по градиенту определенных катионов через мембрану. Ток Na+ внутрь клетки после активации натриевых каналов формирует в кардиомиоцитах фазу деполяризации ПД. По мере нарастания деполяризации проницаемость для Na+ падает вследствие инактивации натриевых каналов, активируются входящие Ca2+-токи, которые формируют фазу плато ПД. Последующая активация различных K+-каналов приводит к реполяризации мембраны кардиомиоцитов до уровня мембранного ПП.
Деполяризация мембраны кардиомиоцитов млекопитающих обеспечивается быстрыми входящими Nа+-токами через соответствующие ионные каналы. Эти каналы в кардиомиоцитах являются потенциалозависимыми и состоят из трансмембранной - и цитоплазматической -субъединицы (рис. 4). Основные канальные функции выполняет -субъединица, а -субъединица является необходимой, модулирующей свойства каналов (Marban et al., 1998). Известно несколько типов Na+-каналов, имеющих различные функциональные и фармакологические характеристики (Maier et al., 2002, 2003, 2004). Так в возбудимых клетках млекопитающих обнаружены четыре цитоплазматические -субъединицы (14), которые могут быть ассоциированы также с различными субъединицами. Роль этих - и -субъединиц в работе Na+-каналов в сердце исследована достаточно подробно (Baroudi et al., 2002; Zimmer et al., 2002).
Альфа-субъединица Na+-канала в кардиомиоцитах человека представляет собой трансмембранный белок, состоящий из 2016 аминокислотных остатков и ассоциирующийся с 1-субъединицей. Этот белок состоит из четырех гомологичных трансмембранных доменов – I, II, III и IV (рис. 4), каждые из которых, в свою очередь, состоят из шести трансмембранных сегментов S1–S6. Белковая молекула канала сконфигурирована таким образом, что сегменты S5 и S6 образуют заполненную водой ионпроводящую пору, а линкер между сегментами – входное устье и селективный фильтр. Участки, ответственные за отдельные функции каналов, были выявлены при помощи специальных методик, в первую очередь, с помощью метода направленного мутагенеза. Установлено, что сегмент S4 играет роль датчика изменений электрического напряжения – сенсора потенциала. Другая важная особенность структуры -субъединицы Na+-канала наличие цитоплазматического линкера между доменами III и IV. Эта цепочка аминокислот важна для нормальной инактивации натриевого канала, которая происходит при деполяризации, когда вышеупомянутый линкер и С-конец Na+-канала закупоривают пору, выполняя функции ворот (Motoike et al., 2004).
Ионный транспорт через Na+-каналы существенно зависит от аминокислотной последовательности трансмембранных сегментов. Известно, что механизм действия противоаритмических средств I класса – блокаторов натриевых каналов (Denisiuk et al., 1991) опосредован связыванием с аминокислотными остатками сегмента S6 домена IV.
В исследованиях последних лет показано, что симпатическая стимуляция приводит к смещению области активации сердечных натриевых каналов в сторону более отрицательных потенциалов, но селективность каналов к Na+ и Ca2+ при этом не изменяется. Свойства Na+-каналов могут модулировать и другие факторы, например, ионы Ca2+. Так был предложен новый механизм модуляции этих каналов при аритмии, состоящий в том, что в таких условиях ионы Ca2+ непосредственно связываются с Na+-каналами кардиомиоцитов.
Таким образом, Na+-каналы, определяя возбудимость кардиомиоцитов и ритм работы сердца, контролируются генетически и в большой степени находятся в зависимости от аминокислотной последовательности канального белка. Их свойства модулируются -субъединицами, а также рядом внутриклеточных факторов, фармакологических средств и, в существенной степени антиаритмическими средствами.
Типы Са2+-каналов и регуляция кальция в кардиомиоцитах. Вход ионов кальция в клетки миокарда играет одну из ключевых ролей в модуляции фазы плато ПД. В возбудимых клетках может быть шесть типов Ca2+-каналов: L, N, P, Q, R и T. В кардиомиоцитах млекопитающих встречаются в основном потенциалозависимые каналы L- и Т-типа, активирующиеся при деполяризации мембраны. Они различаются по своим свойствам, функциям и распределению в разных отделах сердца (Chen et al., 2003).
Кальциевые каналы более разнообразны, чем натриевые и состоят из пяти субъединиц: основной каналоформирующей 1-субъединицы, состоящей из 1873 аминокислот, небольшой 2-субъединицы и дополнительных модулирующих – ß, γ и δ (рис. 5 и 6). Альфа1-субъединица потенциалозависимых Са2+-каналов L- (long-lasting) и Т-типа (transient) имеет сходное строение как между собой, так и с α-субъединицей Na+-каналов и взаимосвязана с вспомогательными -субъединицами. Альфа-субъединица Са2+-каналов также состоит из четырех трансмембранных доменов, каждый из которых сформирован сегментами S1S6, а функции сенсора потенциала выполняет сегмент S4. В левом желудочке сердца человека обнаружены четыре гена, кодирующие -субъединицы Са2+-каналов: Cav14 (Lu et al, 2004).
По сравнению с кальциевыми каналами Т-типа, которые активируются при меньшей деполяризации мембраны и инактивируются очень быстро, каналы L-типа активируются при большей деполяризации мембраны и медленно инактивируются. В сердце наиболее широко распространены каналы L-типа, в синоатриальном узле они способствуют пейсмекерной активности (Zhang et al., 2002), а в атриовентрикулярном узле проведению импульсов через узел (Katz, 1996).
Ca2+-каналы Т-типа экспрессируются в эмбриональных клетках, а также в кардиомиоцитах синоатриального и атриовентрикулярного узла. Они были обнаружены и в клетках Пуркинье (Pinto et al., 1999) и участвуют в пейсмекерной активности. В отличие от Ca2+-каналов L-типа их нет в вентрикулярных клетках взрослых животных, их роль в регуляции сократимости миоцитов незначительна. Временная экспрессия Ca2+-каналов Т-типа имеет место также в зародышевом сердце (Izumi et al., 2003), что свидетельствует об их участии в клеточном росте и пролиферации.
Транспорт и концентрация ионов кальция в клетке регулируется в основном четырьмя механизмами: саркоплазматической и сарколеммной Ca2+-ATP-азой (Ginsburg, Bers, 2004) митохондриальным унипортом Ca2+ и сарколемным Na+/Ca2+ обменником (Reuter et al., 2004). Натрий-кальциевый обменник транспортирует ионы Na+ : Ca2+ в соотношении 3 : 1 или 4 : 1.
Вход ионов кальция в клетку во время ПД ограничивается инактивацией Ca2+-каналов L-типа, которая является кальций-зависимой и вызвана связыванием кальмодулина с C-концами белка Ca2+-каналов (Peterson et al., 1999; Zuhlke et al., 1999). В то же время известно, что изменения в воротных механизмах потенциал-зависимых K+-каналов, например, K+-каналов задержанного выпрямления, приводят к замедлению фазы реполяризации ПД и могут послужить причиной реактивации кальциевых каналов L-типа. Такое последовательное взаимодействие каналов приводит к осцилляциям мембранного потенциала в фазе плато ПД. Следовательно разнообразные Са2+-каналы вместе с Са2+-регулирующими механизмами, определяют уровень свободного кальция в миоплазме и имеют существенное значения для работы кардиомиоцитов.
Kалиевые каналы играют важную роль в формировании ПП и ПД в кардиомиоцитах. Входящие K+-токи определяют величину ПП сердечной клетки, а выходящие K+-токи принимают наибольшее участие в фазе реполяризации ПД. Калиевые каналы (Nerbonne, 2000), по сравнению с натриевыми и кальциевыми, наиболее разнообразны как в кардиомиоцитах, так и в мембранах других клеток.
Калиевые каналы входящего выпрямления (inward rectifier K+-channels, Kir) – с преимущественной односторонней проводимостью внутрь клетки и открывающиеся при гиперполяризации, модулируют ПП и стабильно поддерживают его на уровне, близком к равновесному. Кроме того, модуляция этих каналов играет важную роль в регуляции частоты сердечных сокращений (ЧСС) (Nakamura et al., 1998; Sakman et al., 1983). Показано, что IK1 не только поддерживают ПП и участвуют в формировании ПД, но и модулируют силу сокращений мышечных волокон при изменениях концентрации внеклеточного K+ (Bouchard et al., 2004).
По современным представлениям односторонняя проводимость калиевых каналов обусловлена тем, что при IK1-выходящих токах, канал закупоривается непроницаемыми к внутриклеточным катионам Mg2+ и полиаминами (Ishihara, Ehara, 2004). Эти ионы способны войти в ворота со стороны цитоплазмы, но не проходят через селективный фильтр канала. Цитоплазматическая сторона ворот Kir содержит кислотные и гидрофобные аминокислоты, создающие благоприятную среду для полиаминов, закрывающих ворота канала (Nishida, Mackinon, 2002).
В сердечных клетках желудочков мышей было обнаружено, что деполяризация мембраны приводила к инактивации выходящих K+-токов, а последующая реполяризация их активировала (Fiset et al., 1997). Эти транзиторные следовые токи (Itail) активировались при реполяризации до 80 мВ – значению, близкому к ПП сердечных клеток. При деполяризации от 120 мВ до 80 мВ активации Itail не наблюдалось (Clark et al., 2001). Эти токи, как и IK1, блокировались при аппликации 250 М Ba2+. По-видимому, эти токи возникают благодаря Kir2.1-каналам, которые находятся в t-трубочках. В предсердных клетках, у которых отсутствуют t-трубочки, такая локализация Kir2.1 не была выявлена (Clark et al., 2001). Ионные каналы Kir2.2 также расположены в t-трубочках (Leonoudakis et al., 2001). Каналы Kir2.1 и Kir2.2 формируют входящие токи IK1, и, по всей видимости, в одинаковой пропорции. Последнее предположение обосновано тем, что при исключении гена, кодирующего Kir2.2, ток IK1 был снижен на 50 % (Zaritsky et al., 2001). Более того, изменения в значениях амплитуд IK1 коррелировали с числом t-трубочек в кардиомиоцитах желудочка. Обнаружены также отличия IK1 в разных камерах сердца. Например, у морской свинки величина выходящего компонента IK1 в левом желудочке больше по сравнению с правым (Samie et al., 2001). Разная степень экспрессии IK1 наблюдается в желудочках и предсердиях кролика. Мутация в гене KCNJ2, который кодирует каналы Kir2.1, вызывает уменьшение K+-токов и способствует появлению синдрома Андерсена (Plaster et al., 2001), клиническими показателями которого является увеличение QT интервала и аритмии. На этом основании синдром Андерсена часто рассматривается как подтип синдрома удлиненного QT интервала.
Известно, что ацетилхолин снижает ЧСС в результате активации входящих K+-токов (IKACh) в пейсмекерных клетках синоатриального узла. Здесь ацетилхолин активирует мускариновые ацетилхолиновые рецепторы (mAChR) M2, что, в свою очередь, катализирует обмен ГДФ на ГТФ в -субъединице гетеротримерных G-белков (Gi), активируя тем самым G-белок-зависимые процессы. Димеры - и -субъединицы G-белков диссоциируются от ГДФ связанной -субъединицы и активируют непосредственно IKACh (Soejima, Noma, 1984).
В кардиомиоцитах синусного узла и предсердиях за холин-чувствительные калиевые токи ответственны гетеромерные каналы GIRK1 и GIRK4 (G-protein activated inward rectifier K+-channels) (Krapivinsky et al., 1995). Эти каналы закрыты при отсутствии сигнала, идущего от G-белка, но активируются при стимуляции M2-рецепторов. В отличие от GIRK-каналов, члены подсемейства Kir2 постоянно находятся в активном состоянии и независимо от стимуляции M2 рецептора.
АТФ-зависимые калиевые каналы (KАТР) в сердце по своей структуре – тетрамеры, содержат 2-трансмембранных сегмента. Не зависят от потенциала, обладают свойствами входящего выпрямления, pH-чувствительны. Основная функция – сенсоры глюкозы в β-клетках. Регулируются с помощью ATФ: высокая концентрация АТФ ингибирует активность KАТР-каналов; они открываются при снижении уровня АТФ внутри клетки, например, при гипоксии. Активаторы каналов: левкромакалим, диазоксид, априкалим, пинацидил. Блокаторы – глибенкламид, толбутамид, фентоламин, циклазиндол, лидокаин. АТФ-зависимые калиевые каналы кодирует коэкспрессия Kir6.x со специфическими сульфонилмочевинными рецепторами SUR (sulfonylurea receptor) (Inagaki et al., 1997). Разнообразие АТФ-зависимых калиевых токов в мышечных тканях обусловлено экспрессией разных изоформ субъединиц Kir6 и SUR. Сердечные KАТР-каналы кодирует совместная экспрессия Kir6.2 и SUR2А. Было показано, что ключевую роль в развитии “прекондиционирования” в сердце играют активация и увеличение экспрессии сарколеммных KАТР-каналов (Budas et al., 2004). Доказано, что блокада KАТР-каналов высокой внутриклеточной концентрацией АТФ препятствует развитию метаболической адаптации миокарда к ишемии, ухудшает функциональные показатели сердечно-сосудистой системы, способствует расширению зоны ишемических повреждений сердечной мышцы. Аналогично действует антагонист KАТР-каналов глибенкламид (Маслов и соавт., 2001). Напротив, активация KАТР-каналов при снижении внутриклеточной концентрации АТФ, вызывающая некоторое уменьшение механической активности кардиомиоцитов из-за уменьшения длительности ПД (Ruiz et al., 1992) способствует развитию метаболической адаптации миокарда к ишемии (Budas et al., 2004). Адаптация миокарда к ишемии/реперфузии осуществляется и под действием низкоинтенсивного лазерного излучения (Колпакова и соавт., 2003), одним из механизмов влияния такого рода излучения, возможно, является активация KАТР-каналов. Эти каналы обеспечивают взаимосвязь между метаболическим состоянием клетки и ее электрофизиологическими свойствами. Учитывая уникальность композиции субъединиц KАТР-каналов и их селективную экспрессию в сердце, эти каналы можно использовать как мишень для поиска новых фармакологических средств при лечении ишемии и аритмии. У людей с сердечной недостаточностью и аритмией обнаружены мутации в гене ABCC9, который кодирует SUR2А вспомогательную субъединицу KАТР-каналов (Bienengraeber et al., 2004). При хронической атриальной фибрилляции, которая сочетается с уменьшением длительности ПД, происходит снижение амплитуды KАТРтоков (Balana et al., 2003). С помощью новой методики, основанной на сканировании проводимости ионного канала, была показана активация одиночного KАТР-канала на поверхности мембраны кардиомиоцита (Korchev et al., 2000). Оказалось, что KАТР-каналы образуют маленькие скопления около Z-полоски сердечной клетки. Уменьшение экспрессии KАТР-каналов (как и в случае IK1, см. выше) приводит к уменьшению емкости клетки (Christe, 1999), что коррелирует с уменьшением плотности t-трубочек (Lipp et al., 1996; Mitcheson et al., 1996).
Потенциалозависимые калиевые каналы А-типа (IA) обеспечивают формирование ранней фазы реполяризации (табл. 6, фаза 1). В сердечных клетках эти K+-каналы (Nerbonne, 2000) кодируют -субъединицы Kv1.4 и Kv4.2, они важны для модуляции длительности ПД. Одним из свойств K+-токов А-типа является время-зависимая (транзиторная) инактивация тока (Eghbali et al., 2002; Guo et al., 1999). По этой причине они получили другое название – Itо (transient outward current). Эти каналы активируются независимо от присутствия или отсутствия ионов кальция во внеклеточном растворе, и тем самым их можно отличать от кальций-зависимых K+-каналов (например, Maxi-K+-каналов). Нативные Kv-каналы представляют собой комбинацию мембранной - и цитоплазматической -субъединиц (Trimmer, 1998), а также KChAP (Kuryshev et al., 2000a) и KChiP (Kim et al., 2004a,b).
На основе молекулярнобиологического анализа сделано предположение, что каналы семейства Kv4 ответственны за компоненты пиковых выходящих токов в сердце (Barry et al., 1995; Brahmajothi et al., 1996; Fiset et al., 1997). В клетках желудочка крыс каналы Kv4.2 расположены в основном в t-трубочках и составляют значительную часть выходящих токов Itо (Cha et al., 2004). Эти токи можно блокировать 4-АР (Burashnikov et al., 2004), но они не чувствительны к ТЕА при концентрациях до10 мМ.
К+-каналы задержанного выпрямления сформированы также из четырех -субъединиц и каждая из них содержит шесть трансмембранных сегментов (S1S6). K+-токи задержанного выпрямления в кардиомиоцитах теплокровных состоят из трех компонент: ультрабыстрой, быстрой и медленной. Биофизические, фармакологические и молекулярнобиологические исследования показали, что каждая из компонент обусловлена активностью соответствующего типа субъединицы. Полноценный функциональный канал состоит в основном из двух субъединиц: ;- и ;-субъединицы. Тем не менее, функциональная -субъединица может образовать комплекс и с нефункциональной субъединицей, которая при таких условиях вступает в роли вспомогательной субъединицы. Альфа-субъединицы Kv1.5 обеспечивают ультрабыструю компоненту (IKur, ultra rapid) выходящего тока. Было показано, что эти каналы в отсутствии K+ во вне- и внутриклеточных растворах проводят и ионы Na+ (Wang et al., 2000).
За быструю составляющую реполяризующего тока (IKr, rapid) ответственны альфа-субъединицы K+-каналов, называемые ERG (Ether-go-go-Related Gene), которые более избирательны к ионам калия. Эти каналы составляют подсемейство EAG (Ether-go-go-Gene) потенциалозависимых K+-каналов. Один ген из подсемейства EAG присутствует также в сердце человека (Human ERG; HERG) и здесь он кодирует быструю компоненту K+-токов задержанного выпрямления IKr (Sanguinetti et al., 1995; Trudeau et al., 1995). K+-каналы задержанного выпрямления обнаружены и в кардиомиоцитах синусного узла кролика (Ho et al., 1996).
В сердце человека HERG K+-каналы являются, пожалуй, одними из наиболее важных. Их блокада вызывает замедление фазы реполяризации ПД, что приводит к увеличению их длительности и QT интервала и проявлению LQT-синдрома (удлиненного QT интервала). При мутациях K+-каналов задержанного выпрямления возможны два варианта проявления синдрома – LQT1 и LQT2. Основное функциональное различие между LQT1 и LQT2 заключается в том, что в первом случае ток уменьшается через каналы IKs (KvLQT), а во втором – через каналы IKr (HERG). Это происходит из-за мутации соответственно в генах KvLQT1 (другое название KCNQ1) и HERG (KCNH2). Существуют наследственные формы LQT и те, которые вызваны побочными эффектами многих фармакологических средств. Наследственный LQT-синдром является генетической болезнью, в основе которой лежат различные мутации в аминокислотной последовательности белков каналов, ответственных за фазы реполяризации ПД в сердце (Splawski, 2000). Некоторые из этих мутаций приводят к уменьшению амплитуды K+-токов (Bianchi et al., 2000; Kagan et al., 2000; Wollnik et al., 1997). Что касается мутации генов, то она является основным детерминантом дефективного перемещения белков, а дефект в перемещении и мyтации субъединиц HERG в случае LQT2 синдрома приводят к уменьшению тока задержанного выпрямления. Селективные блокаторы HERG K+-каналов ибутилид и сисаприд могут устранить эту аномалию, что и лежит в основе целесообразности соответствующей терапии.
Дефект перемещения белков происходит, возможно, из-за образования гетеромерных каналов при различных комбинациях субъединиц в эндоплазматическом ретикулуме и в аппарате Гольджи. Этот дефект может быть ответственным за возникновение ряда болезней у человека (Welch, Brown, 1996). Анализ биофизических свойств каналов позволяет предположить, что в случае синдрома LQT2 нарушение функции каналов HERG происходит не только из-за дефектного перемещения белков, но также из-за образования нефункциональных каналов и изменений в воротных механизмах и/или ионной проницаемости каналов (Zhou et al., 1998). Дефекты в гене HERG, связанные с продлением QT интервала, в ряде случаев приводят к внезапной смерти, что происходит, возможно, из-за вентрикулярной фибрилляции. Существует предположение, что продление ПД может увеличить размер “уязвимого окна”, в котором преждевременный стимул может вести к многонаправленному хаотическому распределению фронтов возбуждения.
Среди всех потенциалозависимых K+-каналов HERG-каналы обладают уникальными свойствами, которые проявляются в выпрямлении выходящего тока при деполяризации мембраны (Sanguinetti et al., 1995). Это происходит из-за быстрой инактивации типа С (Smith et al., 1996; Spector et al., 1996). Было высказано предположение, что HERG-каналы могут играть особую роль при экстрасистолах (Samie et al., 2001). Так, при низкой или физиологической концентрации внеклеточного калия, амплитуда HERG-подобного тока при деполяризации небольшая. Увеличение же [K+]o приводит к возрастанию амплитуды входящих K+-токов при гиперполяризации мембраны. Существуют клинические данные о том, что длительный прием пациентами с синдромом LQT2 ионов в виде KCl приводит к увеличению содержания K+ в плазме крови. При этом показатели фазы реполяризации ПД у них приближаются к норме, т.е. длительность QT-интервала значительно уменьшалась и форма Т-волн также нормализовалась (Etheridge et al., 2003).
Одним из активаторов HERG-K+-каналов является внутриклеточный фосфатидил-инозитол-дифосфат (PIP2). В концентрации 10 мкМ он увеличивает амплитуду K+-токов и сдвигает их потенциалозависимость активации в сторону гиперполяризации (Bian et al., 2001). Кроме того, PIP2 приводит к ускорению кинетики активации и замедляет кинетику инактивации. При использовании импульсов, форма которых имитирует ПД, максимальная активация токов совпадает с областью, близкой к окончанию фазы реполяризации ПД (Lu et al., 2001). Полученные данные позволили сделать заключение, что в норме HERG-каналы препятствуют развитию аритмий.
Данный феномен может быть обусловлен двумя механизмами. Во-первых, максимальная активация канала происходит при потенциалах около –40 мВ, при которых кальциевые токи L-типа показывают окноподобную зависимость (window current). Поэтому HERG-токи будут противодействовать реактивации кальциевых L-каналов, которая является основной причиной ранней следовой деполяризации и некоторых аритмий (January, Riddle, 1989). Блокирование K+-токов задержанного выпрямления IKr (HERG) может приводить к деполяризации мембраны и к генерации дополнительных ПД, провоцирующих осцилляции МП. Последние являются кальций-зависимыми осцилляциями в фазе плато ПД. Вторая причина обусловлена тем, что ранний транзиторный выходящий ток после преждевременной стимуляции может подавлять экстрасистолы (Smith et al., 1996).
Сочетание субъединицы KvLQT1 (KCNQ1) и minK (KCNE1) приводит к формированию каналов, обеспечивающих медленную компоненту K+-токов задержанного выпрямления (IKs, slow). Они характеризируются ярко выраженной медленной активацией. При определенных мутациях в гене KvLQT1 наблюдается синдром LQT1 (Splawski et al., 2000). При наличии синдрома LQT1 у человека часто развиваются аритмии, а во время эмоционального стресса в результате активации адренергической системы мозга и повышения ЧСС (Schwartz et al., 2001) они усиливаются. Наряду с LQT существует и наследственный синдром укороченного (short) QT интервала (SQT), который тоже может приводить к внезапной сердечной смерти (Gaita et al., 2003). Укорочение QT интервала в основном характерно для детей (Макаров и соавт., 2004). При такой патологии наблюдается укорочение рефрактерного периода ПД миокарда, провоцирующее вентрикулярную фибрилляцию. Предполагают, что это вызвано высокой активностью K+-токов IKr и IKs (Bellocq et al., 2004; Brugada et al., 2004). Было показано, что блокада IKs увеличивает длительность ПД и эффективного рефрактерного периода в желудочке (Каверина и соавт., 2001). Один из механизмов противоаритмического действия фармакологических средств связывается с блокированием калиевых каналов, в частности – IK1, IK и HERG-каналов (Li et al., 2001).
В заключение следует отметить, что генерация ПД в каждой клетке миокарда, сопровождающаяся быстрой деполяризацией и медленной реполяризацией, в основе которых лежит последовательная активация-инактивация натриевых, кальциевых и калиевых ионных каналов, играет ключевую роль в деятельности сердца. На этом основании можно утверждать, что мутации генов, ответственных за формирование ионных каналов (каналопатии) и/или другие нарушения нормальных соотношений между входящими и выходящими токами (Sanguinetti, Spector, 1997), могут оказывать существенное влияние на функции кардиомиоцитов (Lehmann-Horn, Rüdel, 1997; Bolli, Marban, 1999; Carmeliet, 1999; Coetzee et al., 1999; Lehmann-Horn, Jurkat-Rott, 1999; Nattel, Li, 2000; Felix, 2000). Идентификация причин нарушений в работе ионных каналов будет способствовать правильному выбору соответствующих терапевтических мероприятий для нормализации работы сердца.
Особенности нейронов и их ионных каналов у моллюсков
Ганглионарная нервная система моллюсков занимает промежуточное положение в эволюционном развитии нервной системы от рассеянного диффузного типа к трубчатому, что и отражается на ее структурных и функциональных особенностях. Нервные элементы моллюсков объединены в ганглии, которые связаны друг с другом короткими комиссурами и образуют кольцо. От ганглиев к различным органам тела моллюска отходят соответствующие нервы. Нервная система брюхоногих легочных моллюсков представлена 5-ю парами симметричных и одним несимметричным ганглием – буккальными, церебральными, педальными, плевральными, париетальными и висцеральным, расположенными вокруг пищевода (Ноздрачев и соавт., 1999). Каждый ганглий состоит из коркового слоя, в котором находятся тела нейронов, и центральной части – нейропиля, содержащего аксоны, нейроглию и соединительную ткань. В ганглиях моллюсков встречаются нейроны диаметром до 1000 мкм, их гигантизм обусловлен полиплоидностью, они характеризуются высоким ядерно-плазменным соотношением, форма тела гигантских нейронов обычно округлая или овальная с одним отростком, обращенном к центру ганглия.
Известно, что у роговой катушки по размеру сомы нейронов и количеству отростков у них можно выделить 6 типов нейронов. 1 – гигантские нейроны размером 100–200 мкм с одним отростком; 2 – крупные псевдоуниполярные и среднего размера 40–80 мкм (основная масса нейронов); 3 – крупные и средних размеров 40–80 мкм с большим количеством отростков (3–4 дендрита и 1 аксон), их небольшое количество; 4 – крупные 60–80 мкм двухполюсные нейроны с большим количеством отростков; 5 – крупные и средние 40–60 мкм биполяры с толстыми отростками, отходящими в разные стороны и 6 – мелкие 10 мкм мультиполярные клетки, находящиеся в нейропиле. В ганглиозном слое обнаружены аксо-соматические и дендро-дендритические синаптические связи нейронов. В связи с этим обсуждаются возможные функции нейронов и выделяются: а) эфферентные – униполярные, псевдоуниполярные и мультиполярные нейроны, образующие внутриганглионарные и периферические связи; б) афферентные биполярные нейроны, обеспечивающие межганглионарные связи; в) афферентные многоотростчатые нейроны, обеспечивающие внутриганглионарную рецепцию; г) промежуточные мультиполярные нейроны, образующие межнейрональные и внутринейропильные связи и д) нейросекреторные клетки.
Предприняты попытки идентификации и картирования нейронов моллюсков в ганглиях, при этом у роговой катушки, например, отмечается стабильное положение двух нейронов (А и В) в малом париетальном ганглии, проведено их подробное электрофизиологическое исследование. Известны схемы расположения гигантских нейронов и в других ганглиях.
Уже в первых электрофизиологических исследованиях на нейронах моллюсков отмечалось принципиальное сходство их электрогенеза с электрогенезом клеток позвоночных животных. Обсуждалась функциональная организация нейронов моллюсков, их некоторые особенности – крупное тело, выполняющее преимущественно трофическую функцию, длинный ветвящийся отросток, имеющий пейсмекерные зоны и множество синаптических окончаний, выполняющий интегративные функции. Разработана методика выделения изолированных клеток моллюсков, исследователей привлекает возможность применения метода фиксации потенциала на изолированных нейронах виноградной улитки, роговой катушки и прудовика (Костюк и соавт., 1981).
В нейронах моллюсков обнаружены все основные виды ионных каналов, обеспечивающих генерацию ПД. Входящие натриевые и кальциевые ионные токи принято обозначать соответственно как INa и ICa. Более того, кальциевый ток при малых величинах деполяризующих стимулов так же разделяется на два компонента – обычный и “медленный” кальциевый ток; последний медленно инактивируется и обусловливает наличие длительного “хвоста” входящего тока после выключения деполяризующего стимула (Eckert, Lux, 1975; Дорошенко и соавт., 1978). Еще одной особенностью входящего кальциевого тока нейронов моллюсков является его быстрое снижение в ходе диализа нейрона, связанное, по-видимому, с быстрым вымыванием какого-то фактора из внутриклеточной среды, необходимого для поддержания кальциевых каналов в активном состоянии (Костюк и соавт., 1981; Костюк, 1984). По-видимому, этим фактором является система циклического АМФ, обеспечивающая фосфорилирование мембранных белков, в том числе и компонентов Са2+-каналов. Добавление в диализирующий раствор определенных количеств ионов магния, АТФ и цАМФ значительно улучшает регистрацию кальциевого тока и замедляет процесс снижения кальциевой проводимости во время экспериментов.
Выходящий ток нейронов моллюсков также разделяется на два компонента – быстрый и медленный – задержанный. Быстрый выходящий ток инактивируется уже при ПП и активируется только после предварительной гиперполяризации мембраны до уровня –90 – 110 мВ. Быстрый выходящий ток не блокируется внеклеточным ТЭА, но в значительной степени блокируется при его введении внутрь нейрона. Медленный выходящий ток инактивируется лишь при поддерживаемом мембранном потенциале более –50 мВ, блокируется внеклеточным ТЭА и лишь незначительно при внутриклеточном его действии (Neher, Lux, 1972; Thomson, 1977). Оба компонента выходящего тока, а особенно медленный, блокируются верапамилом, другими блокаторами кальциевых каналов (Костюк и соавт., 1975а, б). Быстрый компонент калиевого тока в мембране сомы нейрона подавляются 4-АР и 3,4-диаминопиридином, который в 50 раз превосходит эффект 4-АР (Meves, Pichon, 1977; Kirsch, Narahasi, 1978). Переносчиком как быстрого, так и медленного компонентов выходящего тока являются ионы калия и соответственно обозначаются как IKf и IKs (Костюк и соавт., 1975b). Наряду с быстрым и медленным выходящими токами в нейронах моллюсков регистрируется остаточный выходящий ток (Ins), нечувствительный к блокирующему действию ТЭА. Он характеризуется медленным нарастанием и отсутствием выраженной инактивации. Кроме того, такая стационарная калиевая проводимость заметно увеличивается при внесении в клетку ионов Са2+. Установлено, что такой компонент выходящего калиевого тока обусловлен наличием в мембране нейрона ионных каналов, отличающихся меньшей специфичностью по сравнению с каналами быстрого и задержанного калиевых токов, отсутствием инактивации и чувствительностью ко входу в клетку ионов Са2+ (Дорошенко и соавт., 1979).
Ионные каналы нейронов моллюсков имеют некоторые особенности по сравнению с таковыми у теплокровных животных, что определяется, вероятно, экспрессией соответствующих генов. Например, аналогичные ионные токи в нейронах моллюсков отличаются более медленной их активацией и инактивацией, есть различия в фармакочувствительности каналов. Так если в соме нейронов моллюсков натриевые каналы практически не блокируются ТТХ, то в нейронах теплокровных быстрый компонент входящего тока обратимо блокируется ТТХ, исчезает при удалении из среды ионов натрия и величина его равновесного потенциала соответствует теоретической для натриевого электрода. В процессе онтогенеза эти свойства изменяются, нейроны новорожденных животных теплокровных более похожи на нейроны моллюсков (Федулова и соавт., 1986). На нейронах спинальных ганглиев лягушки, новорожденных и взрослых мышей и крыс был зарегистрирован ТТХ-устойчивый медленный компонент входящего натриевого тока (Yoshida et al., 1978; Веселовский и соавт., 1980). Его характерной особенностью является то, что он блокировался агентами, традиционно считающимися блокаторами кальциевых каналов – ионами кадмия, кобальта, марганца, верапамилом и D-600. Ток полностью устранялся при удалении из среды ионов натрия и не восстанавливался при повышении концентрации ионов кальция во внеклеточном растворе. Кривая стационарной инактивации медленного натриевого тока, как и кальциевого в нейронах моллюсков, была сдвинута в сторону положительных значений мембранного потенциала по сравнению с таковой для быстрого компонента натриевого тока. Кроме того в нейронах млекопитающих существует новый вид натриевого входящего тока – “гибридный” ток, обладающий всеми характеристиками кальциевого тока, но переносимый исключительно ионами натрия (Костюк, Крышталь, 1981; Костюк, 1986). Регистрируемый в нейронах млекопитающих входящий кальциевый ток (Nowycky et al., 1985; Fox et al., 1987; Dunlap et al., 1995), в отличие от медленного кальций-подобного компонента натриевого тока, не зависит от наличия в окружающем растворе ионов натрия. Он возрастает при увеличении в растворе ионов кальция, характеризуется более медленной активацией и замедленной инактивацией и в большей степени, чем в нейронах моллюсков, зависит от присутствия в диализирующем растворе ионов Mg2+ и АТФ (Веселовский, Федулова, 1980).
Выходящий ток нейронов моллюсков в целом сходен с таковым для нейронов позвоночных (Chady, Gutman, 1995), в которых он так же переносится ионами калия, состоит из быстрого и задержанного компонентов, активируемых при различных уровнях мембранного потенциала. Однако быстрый и медленный ток в меньшей степени поддаются фармакологическому разделению, они примерно в одинаковой степени блокируются как при вне-, так и при внутриклеточном приложении ТЭА или при замене внутри клетки ионов калия на ионы Tris. В большинстве нейронов позвоночных сохраняется, как и в нейронах моллюсков, стационарный неспецифический компонент выходящего тока. Этот выходящий ток нечувствителен к ТЭА, также является кальций-зависимым и в большей степени проявляется при введении в клетку ионов Са2+ и/или цАМФ (Веселовский и соавт., 1980; Костюк, Крышталь, 1981; Костюк, 1986).
На нейронах прудовика описаны глутамат-зависимые катионные каналы, имеющие на 45–50 % сходство в молекулярной организации с аналогичными каналами млекопитающих (Stühmer, 1996).
Таким образом, биоэлектрическая активность нейронов моллюсков и нейронов теплокровных в основном обеспечивается активностью натриевых, кальциевых и калиевых ионных каналов, имеющих общие принципы строения и функционирования (Nicholls et al., 2001). Это позволяет использовать в качестве моделей нейроны моллюсков (Chase, 2002) наряду с нейронами теплокровных животных в экспериментальных исследованиях деятельности ионных каналов и механизмов влияния на них различных физических факторов, химических соединений и фармакологических веществ, являющихся известными или вновь создаваемыми лекарственными средствами.
Используются технологии
uCoz